植物体内游离脯氨酸的测定实验

实验方法原理：在正常环境条件下生长的植物，体内游离脯氨酸的含量较低，但在逆境（如旱，寒，盐等）条件下，植物体内游离脯氨酸的含量可增加10－100倍，因此有人提出游离脯氨酸的含量可作为植物抗逆性指标。

植物体内的游离脯氨酸用磺基水杨酸或酒精提取。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色产物，用比色法于520n M 波长下测定脯氨酸的含量。

实验材料：小麦

试剂、试剂盒：

酸性茚三酮                                                                 

脯氨酸标准溶液                                                                  

冰醋酸                                                                  

甲苯    

仪器、耗材：

分光光度计                                                                  

分析天平                                                                  

恒温水浴                                                                 

研钵                                                                  

容量瓶                                                                  

具塞试管                                                                  

移液管                                                                  

漏斗                                                                

滤纸

实验步骤：

一、仪器设备

分光光度计，分析天平，恒温水浴 ，研钵 ，容量瓶，具塞试管，移液管，漏斗，滤纸

具塞试管：25毫升9支

移液管：2毫升4支，5毫升2支


二、试剂

1．酸性茚三酮：称取2.5克茚三酮，加入60毫升冰醋酸和40毫升6 M 磷酸，于70℃下加热溶解。冷却后贮于棕色试剂瓶中备用。4℃下2～3日内有效。

2．脯氨酸标准溶液：称取0.0250克脯氨酸，溶解在250毫升蒸馏水中，其浓度为100微克/毫升。再取此液10毫升，用蒸馏水稀释至100毫升，即为10微克/毫升之脯氨酸标准液。

3．冰醋酸

4．甲苯

若用磺基水杨酸提取，需要配制3%的磺基水杨酸溶液。（若用酒精提取，需要80%的酒精，活性炭，人造沸石）。

三、材料

生长在灌水及干旱条件下的小麦或其它作物。

四、方法步骤

1．制作标准曲线：取7支25毫升具塞试管，编号。分别向各管准确加入 脯氨酸标准液（每毫升含脯氨酸10微克）0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升，再用蒸馏水将体积补至2毫升，摇匀，便配成了分别含0，2，4，8，12，16，20微克脯氨酸的标准系列。再向各管加入冰醋酸和酸性茚三酮各2毫升。摇匀后，在沸水浴中加热显色30分钟，取出后冷却至室温，向各管加入5毫升甲苯，充分摇动，以萃取红色产物。萃取完后（避光静置4小时以上），待完全分层后，用吸管吸取甲苯层，用分光光度计在520n M 波长下测定消光值，以脯氨酸含量为横座标，消光值为纵座标，绘制标准曲线。

2．游离脯氨酸提取：植物体内的游离脯氨酸可以用3%的磺基水杨酸提取。磺基水杨酸提取：称取新鲜和萎蔫小麦叶片各0.5克，将称好的样品放入具塞试管中，加入5毫升3%的磺基水杨酸溶液，将试管浸入沸水浴中提取15分钟，过滤，滤液待测。

3．测定：吸取滤液2毫升于试管内，与标准浓度的脯氨酸系列溶液同法显色测定。

4．计算：测定结果按下式计算



式中：C＝从标准曲线上查得脯氨酸微克数；
      V＝提取液总体积（毫升）；
      a＝测定时取用提取液毫升数；
     W＝样品干重（克），10⁶＝将克换算为微克。