植物基因组DNA及总RNA提取技术2

（二）植物总RNA提取
 （1）65°C水浴中预热15 mL CTAB提取液。
 （2）液氮中研磨2～3 g新鲜或-70°C冷冻的材料。
 （3）转移样品至有CTAB提取液的离心管中，立即激烈涡旋30s，短时放回 65°C水浴中（4～5 min）。
 （4）加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合，10000 rpm常温离心15 min。
 （5）将上清转移至一新离心管。重复抽提一次。
 （6）将上清转移至一新离心管中，加入 8 mol/L LiCl, 使LiCl的终浓度为2 mol·L-1，即加入1/3体积的LiCl，4°C下沉淀过夜（最多 16h）。
 （7）4°C离心1 h(全速)，弃上清，用500 μL70%乙醇洗沉淀，然后用500 μL100% 乙醇洗沉淀。

（8）用500 μL SSTE 溶解沉淀，转移至1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。
 （9）加入2×体积的无水乙醇，在 -70°C沉淀30 min或-20°C沉淀2 h。
 （10）4°C离心20 min沉淀RNA（全速）。
 （11）先用400 μL70%乙醇洗沉淀，然后用400 μL100%乙醇洗沉淀，吹干后用65 μLDEPC水溶解RNA。
 电泳检测RNA：
 （1）配制1.2%的琼脂糖凝胶（20mL）
 称取琼脂糖0.24 g，加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL，5×RNA 电泳缓冲液4 mL，电炉加热融化琼脂糖，冷却至55°C，加入甲醛1.96 mL，冷却后倒胶。
 （2）RNA电泳
 取去离子甲酰胺10 μL，甲醛1.5 μL，10× RNA Buffer 2 μL，RNA (2～4 μg, <10 μL) 混合液，65°C加热15min，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入3 μL RNA 加样缓冲液和0.5 μL EB，上样电泳。电泳Buffer 为1× RNA buffer。
 出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体RNA（rRNA）分子，即18S 和28S rRNA，较小的RNA也很丰富但看不到，因为太小，跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA（mRNA）经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28S rRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯度好。

RNA提取有其他多种方法，整个流程下来所用时间不同，如专门的试剂盒Trizol可在1.5h内完成RNA的提取工作，但得率较低，适合草本类植物，木本类植物用CTAB法提取的RNA可在1.5d内完成，但得率高，此法可获大量的RNA用于Northern杂交、基因克隆等工作。
 （三）提取的DNA（RNA）的浓度检测
 （1）取少量待测DNA(RNA)样品，用TE或蒸馏水稀释50倍（或100 倍）。
 （2）用TE或蒸馏水做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。
 （3）加入待测 DNA(RNA)样品在三个波长处读取OD值。
 (4) 纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8，高于1.8可能有RNA污染，低于1.8有蛋白质污染；纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0。
 （5）根据OD值计算DNA（RNA）浓度或纯度。
 [SSDNA]=33×（OD260-OD310）× 稀释倍数
 [dSDNA]=50×（OD260-OD310）×稀释倍数
 [SSRNA]=40×（OD260-OD310）× 稀释倍数