植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析

实验概要

掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。

实验原理

十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L  NaCl）是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L  NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。

主要试剂

1 、DNA extraction ：500ml 31.885g  sorbitol (山梨醇)  6.05g    tris   PH8.2  (一般不调)
  2、Nuclei lysis buffer:  500ml 100ml       1M  Tris PH7.5 100ml       0.25M  EDTA 200ml       5M    NaCl 10g         CTAB 100ml       ddH20
  3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐)  500ml 用时，将上述三种溶液按1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l）,65℃预热，既为抽提液。

实验步骤

一、基因组DNA提取 1、取0.15g左右小麦叶片，在液氮中迅速研磨后放入1.5ml离心管中，加入700ul抽体液（65℃预热）混匀， 65℃水浴裂解40-60 min，期间温和混匀几次，加4 ul RNase 室温静置2min。 2裂解好的DNA ，加入500 ul 氯仿：异戊醇（24：1），缓慢混匀，4℃×11 000rpm×10min。 3、取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃静置30 min。 4、将析出的DNA 离心，4℃×11 000rpm×10 min。 5、去掉上清，将沉淀用500ul 70% 乙醇清洗一次， 6、3000 rpm×1 min, 彻底挥发除去乙醇，溶于40ul ddH2O。
 
二、酶切及电泳分析

37℃反应4h，迅速加入2 ul EDTA中止反应。0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。