植物学技术：植物原生质体的制备

原生质体是指植物细胞去掉细胞壁的裸露部分。它在培养条件下，①具有再生细胞壁，进行连续的细胞分裂并再生成完整植株的能力；②具有摄取外源大分子、细胞器，以及细菌，病毒的能力，因此是进行遗传操作，基因转移的好材料；③通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，培育出新品种。

实验原理

去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的首推Klercker（1892），直到1960 年英国科学家Cocking 才*次用酶法大量制备原生质体。本实验以植物的叶肉组织为材料，利用纤维素酶和果胶酶来消化细胞壁，分离细胞。

实验用品

器具：显微镜、离心机、离心管、剪刀（2）、镊子（2）、吸管、小培养皿、载片、盖片。

试剂：0.16mol/L CaCI.2.H2O、20%蔗糖液、酶解液

材料：油菜或菠菜或烟草

实验方法步骤

1、取材 根据实验目的和条件选取不同的材料

2、分离原生质体

① 撕叶下表皮。

② 酶解 将撕去下表皮的叶片剪成小块，放在盛有5mL 酶液的小培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层，在25~28℃下酶解60~90 分钟。

3、收集纯化

（1）用吸管将酶解液吸至5mL 离心管中，以600rpm 离心5 分钟以上，使原生质体沉降。

（2）将上清（酶解液）回收，剩下原生质体及残渣于管底。

（3）加氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀。

（4）用注射器向离心管底部缓缓注入蔗糖约2—3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液。

（5）以600rpm 离心10 分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体。

4、观察或培养

取少许原生质体于载片上，盖片观察其形态，或者将原生质体接种在培养基上进行培养，再生植株。