植物材料RNA的3种提取方法

实验概要

本实验介绍了3种提取植物材料RNA的方法，分别是：RNeasy Plant Mini Kit，TRIZOL试剂盒及CTAB法。

实验步骤

1. 利用RNeasy Plant Mini Kit提取总RNA

    1) 于1.5 ml离心管中加入0.5 ml RLT缓冲液和5ul β-巯基乙醇；

    2) 称取约100 mg材料，液氮研磨后转移到提取液中，涡旋混匀，56℃，2 min；

    3) 加入紫色柱子，23℃， 12000 rpm，离心2 min；

    4) 滤液转入一新的1.5 ml离心管中，加入1/2体积的无水乙醇，用枪头混匀，移入粉色柱子，23℃， 12000 rpm，离心15 sec；

    5) 弃滤液，加入700 ul RW 1，23℃，12000 rpm，离心15 sec；

    6) 将柱子移入一新的2 ml收集管，加入500 ul RPE，23℃， 12000 rpm，离心15 sec；

    7) 弃滤液，加入500ul RPE，23℃， 12000 rpm，离心2 min；

    8) 加20 ul DEPC处理过的水，室温静置15 min，23℃，12000 rpm，离心1 min；

    9) 再分别加入40 ul和20ul DEPC处理过的水，室温静置15 min，23℃，12000 rpm离心1 min；

    10) 合并三次收集的RNA，取2ul电泳检测纯度和质量。-20℃短时间保存，或-80℃长期保存。

2. 利用TRIZOL试剂盒提取RNA

    1) 于1.5 ml离心管中加入1 ml TRIZOL提取液；

    2) 称取约100 mg液氮研磨后的材料，转移到提取液中，混匀，2-8℃，≤12000 g离心10-15 min；

    3) 取上清，于15-30℃放置5min，加0.2 ml氯仿，剧烈摇动15 sec， 15-30℃放置2-3min，2-80C， ≤12000 g，离心15 min；

    4) 取水相，加等体积异丙醇，15-30℃放置10 min，2-8℃，<12000 g，离心10 min；

    5) 用75%乙醇洗涤沉淀，2-8℃，<7500g离心5 min;用DEPC处理的水溶解RNA，-20℃短时间保存，或-80℃长期保存。

3. CTAB法提取植物总RNA

    1) 50 ml离心管中加入15 ml CTAB提取缓冲液(需加入300ul β-巯基乙醇)，65℃预热；

    2) 称2-3 g新鲜的植物材料，在液氮中充分研磨成粉末；

    3) 样品转入50 ml离心管中，迅速震荡混匀至无成团结块，65℃温浴10 min，再加入15 ml氯仿，混匀；

    4) 室温下，10000 rpm，离心15 min，上层水相移入一个新的离心管，加入等体积的氯仿，混匀后再抽提一次；

    5) 将上层水相转入另一离心管中，加入 8M的LiCl，使终浓度为2M(约加入水相的 1/3)，4℃，过夜；

    6) 4℃，12000 rpm，离心20 min沉淀RNA弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，晾干；

    7) 加入500ul SSTE溶解沉淀，转移至1.5 ml离心管中，加入等体积酸性酚/氯仿后混匀；

    8) 室温下，13000 rpm，离心10 min，将上层水相转移至另一1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿后混匀；

    9) 室温下，13000 rpm，离心10 min，上层水相转移至新管中，加入1/10体积的3M NaAC和2倍体积无水乙醇，-80℃静置30 min；

    10) 4℃，13000 rpm，离心20 min，70%乙醇洗涤沉淀，烘干后加入50 ul DEPC处理H₂0溶解RNA，取1ul电泳检测，-80℃保存备用。

4. RNA的纯化

    1) DEPC水处理的1.5 ml离心管中加入：45ul  RNA，7.5ul l0XDnase Assay Buffer，20U RNase inhibitor 1.5ul Dnase I，混合液于37℃温浴30 min；

    2) 用DEPC-H₂0将溶液体积调至250ul，加1/10体积的3 M NaAC(pH 5.2)和2倍体积冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置30 min；

    3) 4℃，12000 rpm，离心20 min，沉淀RNA；

    4) -20℃预冷的70%乙醇洗一次，-20℃预冷的100%乙醇洗一次；

    5) 干燥后，用20 ul DEPC处理的H₂O溶解，-20℃保存。