植物染色体显带技术和带型分析

实验概要

学习和掌握植物染色体Giemsa显带技术和带型分析方法，进一步鉴别植物染色体组和染色体结构。

实验原理

对植物有丝分裂中期染色体进行酶解，酸、碱、盐等处理，再经染色后，染色体可清楚地显示出很多条深浅、宽窄不同的染色带。各染色体上染色带的数目、部位、宽窄、深浅、相对稳定，为鉴别染色体的形态提供依据，也为细胞遗传学和染色体工程提供新的研究手段。
  植物染色体显带技术包括荧光分带和Giemsa（吉姆萨）分带两大类。在植物染色体显带上最常用的是Giemsa分带技术，其中C带和N带较为常用。C带的形成认为是高度重复序列的DNA（异染色质）经酸碱变性和复性处理后，易于复性，而低重复序列和单一序列DNA（常染色质）不复性，经Giemsa染色后呈现深浅不同的染色反应。这种差异反映染色体结构的差异。  

主要试剂

0.05％秋水仙碱溶液，卡诺氏固定液，无水酒精，盐酸，冰醋酸，Giemsa液，5％氢氧化钡，2×SSC溶液，1M NaH2PO4溶液，1％纤维素酶和果胶酶混合液，1/15磷酸二氢钾和1/15磷酸氢二钠缓冲液等。

主要设备

显微镜（附摄影装置），半异体致冷器，冰箱，恒温水浴锅，电子天平，液态氮装置，容量瓶，试剂瓶烧杯，染色缸，载玻片，盖玻片等

实验材料

洋葱、蚕豆、大麦、黄麻的根尖。

实验步骤

1、染色体分带 （1） 材料准备：洋葱鳞茎发根长50px左右，切取根尖进行预处理。蚕豆种子浸种发芽，待幼根长至75px左右，切取根尖进行预处理。蚕豆主根根尖切去后继续长出的次生根，可再切取次生根根尖进行预处理。大麦种子发芽至幼根长25px左右，切取白色的幼根进行预处理。
（2） 预处理：洋葱和蚕豆根尖在0.05％秋水仙碱溶液中预处理2－3h。处理温度一般为25℃。预处理后须用清水冲洗多次，洗去药液。
（3） 固定：以上各材料经预处理后，放入卡诺氏固定液中固定0.5－24h，转换到70％酒精，置于冰箱中保存备用。
（4） 解离：洋葱、蚕豆根尖在0.1N盐酸溶液中置于60℃恒温下处理10~15min。大麦根尖在37℃下用1％果胶酶处理30min，然后在0.1N盐酸溶液中置于60℃下处理5min。 上述材料用酸处理后，须用蒸馏水冲洗多次，除去残留酸液，否则将会影响染色体的显带效果。
（5） 压片：与常规的植物染色体压片方法相同。在45％醋酸中压片，制成白片。在相差显微镜下检查染色体分散程度，挑选出分裂相多，染色体分散均匀的片子。选出的玻片经液氮、CO2干冰或半导体致冷器冻结，用刀片揭开盖玻片。置室温下干燥。
（6）  空气干燥：脱水后的染色体标本一般需经过4－7天的空气干燥，再进行分带处理。不同的材料所需干燥的时间不一样。洋葱要求空气干燥的时间较严，未经空气干燥的染色体不显带，干燥一周后经显带处理显示末端带，干燥半个月后能同时显示末端带和着丝点带。而蚕豆、黑麦、大麦则要求干燥时间不十分严格。
（7） 显带处理：空气干燥后的染色体标本即可进行显带处理。处理方法不同，可显示不同的带型。 C带HSG法（Hydrochloric acid Saline Giemsa  method）将空气干燥后的洋葱、蚕豆染色体标本浸入0.2N盐酸（25℃左右）分别处理30和60min。用蒸馏水冲洗多次后，在60℃的2×SSC溶液中保温30min，再用蒸馏水冲洗数次，室温风干，即可染色。 BSG法（Barium Saline Giemsa method）   将空气干燥后的黑麦、大麦的染色体标本浸入盛有新配制的5％氢氧化钡饱和液的染色缸中，在室温条件下处理5－10min，然后用蒸馏水小心地多次冲洗浮垢后，在60℃的2×SSC溶液中保温60min，再用蒸馏水冲洗数次，室温风干，即可染色。 N带   将黑麦、大麦种子发根25px左右切取，在0℃冰水中预处理24h。卡诺氏固定液中固定半小时以上，1％醋酸洋红染色液中染色2h，然后在45％醋酸中压片，冰冻法揭开。尔后在45％醋酸60℃条件下脱色10min，再在95％酒精室温下脱水10min，气干过夜。最后在1M  NaH2PO4溶液中95℃恒温下保温2min，蒸馏水冲洗，气干后即可染色。
（8）  吉姆萨染色:吉姆萨母液用1/15M磷酸缓冲液按一定的比例稀释。例如，10份磷酸缓冲液加1份吉姆萨母液稀释即为10：1，一般都采用扣染法染色。在一干净的玻璃板上，对称放置两根牙签或火柴棒，距离与载玻片上的材料范围相等。将带有材料的玻片翻转向下，放在牙签上，然后沿载玻片一边向载玻片与玻璃板之间的空隙内缓缓滴入染色液，在室温下染色。染色时间因材料而异，因吉姆萨染料批号不同、质量上有差异，因此其染色液浓度和染色时间需作适当调整。下列材料的染色浓度和染色时间可供参考。

 (9) 镜检和封片:染色后的玻片标本，用蒸馏水洗去多余染料，染色过深可用磷酸缓冲液脱色。室温下风干后即可镜检，挑选染色体带型清晰的片子，用树胶封片。   2、染色体带型分析 经过上述处理的植物染色体标本，可以显示出C带或N带的带型，一般有以下四种带型： （1） 着丝粒带（C带）  带纹分布在着丝粒及其附近，大多数植物的染色体可显示C带。蚕豆、黑麦、大麦等的染色体着丝粒带比较清楚，洋葱染色体的着丝粒带较浅。
  （2） 中间带（I带）  带纹分布在着丝粒至末端之间，表现比较复杂，不是所有染色体都具有中间带。
（3） 末端带（T带）  带纹分布在染色体末端。洋葱和黑麦染色体具有典型的末端带，而蚕豆、大麦的末端带不明显。
（4） 核仁缢痕带（N带）  带纹分布在核仁组织者中心区。蚕豆的大M染色体和黑麦的第Ⅶ染色体具有这种带型。 同时具有以上四种带型的叫完全带，以“CITN”表示，其它称为不完全带，有“CIN”和“以CTN”型、“TN”型和“N”型。 根据植物各染色体上显示的不同带纹和带纹的宽窄，可按染色体组型分析的方法对同源染色体进行剪贴排列，绘出模式图，从而对各染色体的带型作出分析。