植物组织总RNA的提取

实验概要

由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏RNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外，为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。

细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。                                                                                                                              

主要试剂

1. 异硫氰酸胍变性液：工作液各成分的终浓度为：

4mol/L异硫氰酸胍

25mol/L柠檬酸钠pH 7.0

0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)

0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)

2. 3mol/L和2mol/乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)

3. 水饱和酚（pH 3.5）和49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇

4. 4M的LiCl和70%乙醇（用DEPC处理水配制）

5. DEPC处理后高压灭菌水                                                                                                                              

实验步骤

1．取0.5-1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。

2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入3ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。

3．顺序加入2mol/l NaAc 0.3ml、水饱和苯酚3ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。

4．4℃条件下8000rpm离心15min，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h或更长。

5．4℃条件下8000rpm离心15min，小心去除上清液，沉淀溶于1ml 4M的LiCl，转移至微量离心管中，4℃，13000rpm，15min。

6．弃上清，沉淀用0.4ml的DEPC水溶解，加200ul的水饱和酚和200ul的氯仿，混匀，离心，4℃，13000rpm，15min。

7. 吸取上清至新的离心管，加等体积的氯仿再抽提一次，4℃，13000rpm， 5min，吸取上清至新的离心管，加0.1倍体积的3M的NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃1h。

8．离心弃上清，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。                                                                                                                              

注意事项

RNA提取过程中，为了保证所提取的RNA的纯度和完整性，其中有几个方面的问题需要特别控制：

1.去除与RNA结合的蛋白质.

2.避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠（SDS）等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。

3.为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。

4.避免在操作中说话聊天，也可以戴口罩以防止引起RNA酶污染。

5.如果您需要远距离运输或长期储藏RNA样品，建议先将标本（细胞、组织）保存在RNA保存液（RNAwait、RNAlater）中，使细胞内的RNA与RNA酶分离，在室温可以保存7天，4℃可以保存4周，-20℃、-80℃可以长期存档保存标本，RNA质量不受影响，用各类方法抽提仍可以获得高质量的RNA。