植物RNA的制备实验

RNA

TE LiCl 无水乙醇 乙酸钠 氯仿

匀浆器 离心管 离心机 水浴锅

1.  研钵和研棒先用液氮冷却，称出15 g 冻结植物组织于研钵中（加液氮保持冻结）。

2.  用研棒磨成粉末，立即转移到一个盛有150 ml，研磨缓冲液和50 ml TLE缓冲液平衡酚的500 ml 烧杯中。

3.  用Poltroon匀浆器，设定在5~6挡匀浆2 min，加入50 ml 氯仿，并用匀浆器在低速下混匀。

4.  将混合物移至500 ml 的Nalgene离心瓶中，于50℃加热20  min。

5.  于4℃用JA-10转子在17 700 g 下离心20 min。

6.  将上层水相移至另一个干净Nalgene离心瓶中（界面保留待后继步骤4处理），加入50 ml TLE缓冲液平衡酚，混匀，再加50 ml 氯仿。

7.  将上步残余的水相连同界面上的物质移入一 50 ml Oak Ridge离心管中，于4℃用JA-20转子12 100 g 离心20 min。

8.  吸出水相、与步骤3的水相和酚、氯仿混合物合并，剧烈混和。

9.  于4℃用JA-10转子17 700 g 离心15 min，水相移入另一干净500 ml 离心瓶。

10.  用TLE平衡分反复抽提水相，直至两相间界面干净为止，水相再以氯仿抽提。

11.  将水相移入250 ml Nalgene离心瓶中，加入LiCl至终浓度为2 mol/l（加约0.33体积的8 mol/l LiCl），在4℃沉淀过夜。

12.  于4℃用JA-14转子15 300 g 离心20 min，沉淀以2~3 ml，2 mol/l LiCl溶液冲洗。

13.  沉淀以5 ml 水重溶，并移入15 ml Sarstedt 离心管中，加入LiCl溶液至2 mol/l于4℃沉淀RNA 2 h 以上。 

14.  于4℃用JA-20转子15 300 g 离心20 min，用2 mol/l LiCl溶液沖诜一下，重溶干2 ml。

15.  加入200 μl 3 mol/l 乙酸钠溶液和5.5 ml无水乙醇，-20℃沉淀过夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。

16.  于4℃用JA-10转子17 700 g 离心15 min，用1 ml 水重溶沉淀，取10 μl 稀释至1 ml 测A₂₆₀和A₂₈₀。