模板DNA的准备、实验的组织和PCR扩增实验

PCR 缓冲液ddH20基因组 DNAdNTP寡核苷酸引物

离心机和转子丙烯酸防护板过滤阻挡吸头多道移液器PCR 仪托盘 固定器装置底座管盖小管

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

含 15 mmol/LMgCl₂ 的 10XPCR 缓冲液 (GeneAmpPCR 缓冲液 I，AppliedBiosystems)

灭过菌的 ddH₂0

2. 酶和酶缓冲液

TaqDNA 聚合酶，(AppliedBiosystems 或 Invitrogen)

3. 核酸和寡核苷酸

基因组 DNA

10 mmol/L dNTP(GeneAmpPCRdNTP 混合物，AppliedBiosystems)

寡核苷酸引物（Invitrogen 公司合成，稀释成 lOumol/L)

4. 离心机和转子

用翻转吊桶式转子和微板适配器离心

5. 专用设备

丙烯酸防护板（acrylicshield)

过滤阻挡吸头（filterbarriertips)

多道移液器（Eppendorf 或 ApogentDiscoveries)

PCR 仪，96 孔（AppliedBiosystemsGeneAmp9700)

托盘/固定器装置和底座，96 孔（AppliedBiosystems)

管盖，一条 8 个（USAScientific 或 AppliedBiosystems)

小管，0.2 ml，一条 8 个（USAScientific 或 AppliedBiosystems)

二、方法

1. 在冰上融化 dNTP、10XPCR 缓冲液和未标记的引物。Taq 酶在加入反应混合物之前应保存在-20°C。在丙烯酸防护板后融化标记的引物。

2. 每一个反应的混合物包括：

灭菌 ddH₂0                                       6.95ul

含 MgCl₂ 的 10XPCR 缓冲液            1.25ul

10mmol/LdNTP                                  0.25ul

10mmol/L 未标记引物                        0.5ul

标记引物                                            0.5ul

在优化实验条件过程中，如果 PCR 产物的放射信号强度太低，可以增加标记引物的用量，同时按相应

比例调整 ddH₂0 的体积。

TaqDNA 聚合酶（终浓度为 0.25U)     0.05ul

对于一个 96 孔微孔板，准备用于 100 个反应的混合物。

3. 混匀，按等份加入放置在冰上的 PCR 板中（9.5ul/样品）。

4. 用多道移液器加入 3ulDNA(60ng)，混匀。

5. 把盖子盖紧，将板放入预热到 94°C 的 PCR 仪中。

6. 如果产物大小是 200bp, 扩增 30 个循环。循环参数如下：94°C 初始变性 5 min;30个循环的 94°C 变性 30s; 根据经验确定的退火温度（Tm) 退火 30s;72°C 延伸 30s。最后一步 72°C 延伸 7 min。值可以通过引物序列计算出来，公式为 2(A+T)+4(G+C)。

7. 扩增完成后，将样品于-20°C 冻存，或者直接进入方案 3。