氨基酸代谢标记实验_备择方案3长期细胞标记

长期标记意味着对细胞进行 6～32 h 持续的代谢标记。该方法特别适用于研究合成速度相对较慢的蛋白质或研究成熟的标记蛋白而不是生物合成的前体。稳定状态的标记是长期标记的一种形式，在此过程细胞和放射性标记的氨基酸一起孵育直至放射性标记蛋白的合成和降解速率相当。如果蛋白质复合体中的亚基的初级结构已知，该方法可以对这些亚单位进行化学计量。所加入的未标记的甲硫氨酸量依赖于某些因素，如标记的时间和细胞浓度。通常使用的培养基中含有 5％～20％ 正常的非标记甲硫氨酸含量。

细胞悬液／贴壁细胞[35S]标记L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]标记蛋白质水解产物

PBS(冷冻)37℃ 长期标记培养基

75 cm2 组织培养瓶

1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液（见基本方案步骤 1）。

2.1 对于悬浮细胞：用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次（见基本方案步骤 2）。

在 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液中重悬 0.5 ×10⁷～2 ×10⁷ 细胞，并转移到 75 cm² 组织培养瓶中。

2.2 对贴壁细胞： 75 cm² 组织培养瓶中生长 0.5 ×10⁷ ～2 ×10⁷ 的贴壁细胞（80% ～90%融合），在 CO₂ 培养箱中。用预热的长期标记培养基洗细胞一次（见备择方案 1 步骤 3）。每个 75 cm² 组织培养瓶中加入 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液。

3. 拧紧盖子以防 [³⁵S] 标记的化合物挥发。在 CO₂ 培养箱内培养 16 h。

4. 洗细胞并测定掺入量（见基本方案步骤 5～7；或备择方案 1 步骤 6～8）