水质对HPLC、LCMS影响

　　摘要：优化的高效液相色谱法分析需要高纯度溶剂和试剂。水质是非常重要的，它不仅是高效液相色谱法的一种溶剂，同时在样品配置，标液和空白对照中起作用。大量实验表明，中痕量有机物的水(用于流动相)存在可能影响高效液相色谱实验结果。特别是在进行痕量级别的分析时，有机物可能会导致杂峰出现，基线漂移。柱效可能会阻塞，导致分辨率降低，峰拖尾。水中的有机物可能极大地影响液相色谱-质谱分析的结果。有机污染物易电离，就会与分析物结合，从而影响实验结果。

　　本文主要研究在常规的高效液相色谱法分析下，使用新鲜制取的低总有机碳 (TOC)超纯水的好处。低的总有机碳通过 UV 光氧化技术来实现从而达到含量小于 5 ppb 的 TOC 级别。高效液相色谱级瓶装水和低 TOC 新鲜制取的超纯水作为弱溶剂梯度洗脱，用乙腈作为强溶剂，分离七种药剂混合物。重复多次实验，进行初始和最终色谱性能比较。结果表明，随着时间的推移，使用新鲜制取的低总有机碳 (TOC)超纯水仍能很好的被色谱柱分离。通过 LC-MS 检测不同 TOC 水平的水质处理的预浓缩水样表现出来的效果不一样。预浓缩的水被分析柱洗脱，紫外处理和质谱的数据显示使用新鲜制取的低总有机碳 (TOC)的超纯水能获得更好的基线。

　　实验方法:

　　药剂的混合

　　以下按照色谱药品标准来自 Alltech 浓度 1 毫克/毫升

　　在甲醇溶解: 对乙酰氨基酚、 乙酰唑胺 、卡马西平、苯巴比妥 、苯妥英、萘丁美酮和速可。混合物制备每种药品含 0.200 μ g/m l 。

　　流动相

　　水和乙腈作为流动相。水有两个来源: HPLC 级瓶装水(Fisher) 和 Milli-Q Gradient A10 (Millipore)并通过0.22 微米的 Millipak ®所制造的新鲜水。乙腈是高效液相色谱级(Fisher)。

　　仪器：高效液相色谱系统: Waters 510 HPLC 色谱泵；717 加自动进样器；9966 光电二极管阵列，设置在190-400 毫微米的探测器；列: SymmetryShield RP18 (Waters), 3.5 μ m，4.6 x 150 毫米。

　　程序

　　25 μ L 注射药物混合通过 0.45 μ m 13 毫米 Millex ®-LCR 过滤装置过滤。

　　按照以下的梯度洗脱 (水: 乙腈)

　　组分的混合物的分离:

　　80%至 30%水的 15 分钟

　　30%至 80%水 1 分钟，再进行 80%水 4 分钟

　　两种不同类型的水作为流动相

　　纯化链:

　　结果和讨论:

　　图 1：在 214 nm，流动相分别为(A) 高效液相色谱级水、 (B) 与 TOC< 5 ppb 超纯水图谱 1-对乙酰氨基酚、 2-乙酰唑胺、 3-苯巴比妥、 4-卡马西平，5-苯妥英、 6-速可，7-萘丁美酮

　　图 2：在 254 nm，流动相分别为(A) 高效液相色谱级水、 (B) 与 TOC< 5 ppb 超纯水图谱。请注意在图谱 A 显示的杂峰

　　图 3：. 使用相同药物混合物在重复注射 780 次后峰面积变化。

　　图 4：(A) 水有无紫外灯氧化的图谱对比。(B) 无紫外灯氧化水在 13.1 分钟质谱图谱 (TOC = 12 ppb)。

　　(C) 紫外灯处理的水(TOC = 4 ppb)在 13.1 分钟质谱图谱

　　高效液相色谱法通常建议使用 HPLC 级瓶装水为流动相的制备。这种类型的水被证明有低紫外线吸收度和能释放离子。因此，这种规格的水含有一定的有机杂质。这种杂质会影响高效液相色谱法分析，尤其是在梯度洗脱。有机杂质将色谱填料结合，色谱被洗脱最终出现杂峰。这就会给色谱分离带来困难或错误。此外，这些杂质会导致基线升高，降低灵敏度。采用双波长 [185 + 254 nm] UV 灯能生成羟基自由基(OH) (方案 A)氧化有机分子，有效降低 TOC 到低 ppb 水平 (通常 < 5 ppb)。最终产物有机酸是经过紫外灯再由混合离子交换树脂接留下来的。

　　此次研究，将高效液相色谱级瓶装水和 TOC<5 ppb 新鲜制取的超纯水作为洗脱剂对 7 种药物混合物(数字 1-3) 高效液相色谱法分离比较。混合物被反复注射，对第 50 和 1310 次 注射图谱进行了比较。图1 和图 2 分别 是 214 nm 和 254 nm 图谱，显然，在进行 1260 次重复实验后，使用低 TOC 新鲜制取的超纯水比高效液相色谱级瓶装水基线更稳定。在同样的重复注射后，高效液相色谱级瓶装水显示基线往正方向漂移。在图 2A，在重复注射第 1310 次的 HPLC 级瓶装水约 5 分钟后出现杂峰。这可能是由于有机物污染物结合到色谱填料上被洗脱下来。图 2B 使用了超纯水并没有出现杂峰。图 3 对比之间第 50 和1310 次注射色谱峰的峰面积的变化。当采用超纯水，峰面积的变化较少。图 4 LC-MS 数据表明紫外灯氧化能降低纯水中的有机污染物。185/254 nm UV 灯被关闭时，会出现若干杂峰 (图 4A，蓝色标记)。图4B 显示在 13.1 分钟出现的峰值最大。图 4B 显示在 13.1 分钟峰的质谱图， m/z 279 是峰值最高的。当UV 灯打开后，这个峰值显著降低。 (图 4A 中的粉红色标记，质谱在图 4)。

　　结论:

　　TOC<5 ppb 新鲜制取的超纯水作为流动相进行 HPLC 分析能避免杂峰的出现，有助于明确识别的峰外

　　观，更重要的是在定量分析研究中是必不可少的。

　　• 使用这种高质量水的基线漂移最小化。

　　•通过 UV 灯氧化处理得到低 TOC 超纯水可以获得高效率的前处理系统