活细胞荧光成像的新型标记法及其在STED中的应用（一）

如何免除活细胞标记中的清洗（washout）步骤？

SNAP-tag等标记方法为活细胞显微成像带来了革命性的变化，也因此被Nature杂志评为2004年最热门的科研技术之一。但是传统的SNAP-tag标记仍然有很大的缺陷。将带有荧光探针的底物BG加入细胞后需要多次清洗细胞，才能将未结合的BG去除从而消除背景荧光对成像的影响。即不能实时在底物与SNAP-tag结合的过程中，跟踪SNAP-tag融合蛋白的动态变化。YasuteruU等科学家基于SNAP-tag研发了一种荧光偶联性激活标记方法（fluorescenceactivation-coupled protein labeling, FAPL），通过改造SNAP-tag的底物来解决这一问题，从而能够实时的记录细胞内一些动态的生命过程，如蛋白表达、定位、转运及降解等过程[13-15]。在Snap-tag底物BG鸟嘌呤的C-8位置引入一个淬灭基团，可以有效的通过荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)或光诱导电子转移（Photoinduced electron transfer，PET）吸收BG上标记的荧光基团荧光能量，使其在与SNAP-tag结合之前是不会发出荧光的。一旦底物与SNAP-tag结合，该淬灭基团就会解离下来，荧光基团将发出荧光（图4）。因此荧光信号只有在SNAP-tag融合蛋白上才会被点燃，所以也就不再需要任何的清洗步骤。Utrano及其同事已经成功的将这种标记方法应用于研究细胞运动中表皮生长因子受体（EGFR）相关的膜运输过程（图5）[13]。

图3.HEK293活细胞中ATTO647N和Chromeo494分别标记的EGF和EGFR的STED超高分辨率成像。由图E、F、K、L可以看出，STED对EGFR-EGR复合体的成像分辨率比共聚焦提高了3~4倍。

图4. 传统的SNAP-tag标记方法与基于FAPL的SNAP-tag标记方法比较