活细胞RNA检测一步轻松实现

　　一提到RNA的检测，大家的脑海中可能会立即浮现出：RT-PCR、FISH、Northern blot等。的确，这些都是检测RNA的经典方法，但它们需要裂解、固定、RNA抽提等，颇为繁琐。其实，RNA的检测完全可以更smart。默克密理博最新推出的SmartFlare™ RNA“灵光”技术，只需一步孵育即可直接检测活细胞内特异的mRNA或miRNA，不仅简便，更可实现以往的方法所不能做到的突破性新实验设计。

　　这种与众不同的SmartFlare RNA检测探针源自美国三院院士Chad Mirkin教授开发的NanoFlare技术。每个SmartFlare探针都是一个纳米金颗粒，上面连接着多拷贝的双链寡核苷酸序列：报告链和捕获链。报告链上带有荧光基团，在靠近纳米金颗粒时，荧光淬灭。当目标RNA与纳米金颗粒上的捕获链结合时，报告链被释放，上面的荧光基团会发出荧光，通过荧光检测平台检测到。

　　原理就是这么简单，实验操作更简单。在您的培养物中加入SmartFlare探针，孵育过夜，第二天检测，OK。无需细胞裂解，无需RNA抽提和扩增，也无需转染试剂。SmartFlare探针利用细胞自身的内吞机制进入活细胞，而且，在检测完成后，探针可以从细胞中排出，不影响下游检测。

　　如此smart的RNA检测技术，难怪一上市就备受瞩目。SmartFlare RNA“灵光”技术不仅被生物通读者评为2013年度生命科学十大创新产品，也斩获了两项国际创新科技奖：The Scientist Top 10 Innovations 2013和The Analytical Scientist Innovation Awards 2013。如今，这项技术已经应用在细胞分选、干细胞分化发育研究等多个方面，也有不少文章发表。

　　突破性胞内标志物活细胞分选

　　传统意义上的细胞分选是通过检测细胞表面蛋白标记物来实现的，这需要使用荧光标记的抗体。不过，如果蛋白标记物在胞浆内，则不能通过这种方法分选，因为抗体染色的过程需要固定、透化等步骤。有时候可通过转染入报告基因而达到分选细胞的目的，但是，这种方法可能会损害细胞的完整性，也可能扰乱细胞信号通路、干扰下游分析。之前由于只能局限于使用细胞表面标志物来分选细胞，大大限制了许多细胞分选的效率及纯度，比如肿瘤干细胞的分选。

　　现在利用SmartFlare检测试剂，我们能够根据基因表达水平，或结合表面蛋白标记物，完成细胞的分选，并进一步增殖活细胞群体。这种技术在检验胞内的标记物时不需要固定或透化细胞，也不需要转染试剂，让细胞在分选后仍然保持完整。更重要的是，这种颗粒是惰性的，对细胞无害，而且检测完成后SmartFlare颗粒会离开细胞，这意味着我们就能对分选出的细胞进行更多的生物功能研究。

　　这种根据RNA水平来检测和分离细胞的能力为我们探索细胞功能打开了一扇新的大门，也让我们能够对传统方法很难分选的细胞(如肿瘤干细胞)进行分选，并通过胞内标记物提高分选的准确性。

　　这一方面的应用成果已在著名期刊上发表。西北大学Feinberg医学院的研究人员总结了近期的黑色素瘤研究成果，认为Nodal信号通路的重新出现意义重大，它有望成为预后标志物和治疗靶点1。然而，Nodal是分泌蛋白，很难直接测定表达Nodal的黑色素瘤细胞的功能相关性。

　　他们认为，传统技术(如免疫组化、Western blot和RT-PCR)虽然能够测定Nodal的表达，但无法特异分选表达Nodal的亚群，用于进一步的功能研究。多亏有了特异针对Nodal mRNA的SmartFlare，黑色素瘤亚群的分选才得以轻松实现。这种方法最终鉴定出CD133在Nodal高表达的细胞中升高，有助于阐明 Nodal在黑色素瘤发展中的作用。