流式细胞的具体实验步骤

一 、细胞表面标记的检测
1.试剂平衡至室温。准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。
2.写编号纸并编号。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD33----CD14/CD454----
3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血，震荡，室温避光20分钟。加血前摇匀血样。
4.加入溶血素1ml，震荡后室温避光10分钟。
5.离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。
6.加入PBS洗液2ml，震荡，离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。
7.加入PBS 900l。上机前4度保存。
8.上机。
二 、细胞内细胞因子的检测
1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。
2.写编号纸并编号。IgG1/ CD8/CD3IFN-gamma; /CD8/CD3
3.（3－5在超净台操作）取出PMA（1∶100），BFA（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠PBS稀释储存液。
4.刺激：取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1 106 ）50l/管，再加入50l RPMI1640进行稀释一倍，加入刺激剂PMA，离子霉素和BFA，混匀。最后在全血中的终浓度：PMA:50ng/ml离子霉素：1g/mlBFA：10g/ml。
5.37℃，5% CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖) 。
6.胞外染色：各管中加入相应的表面抗体20l和激活的全血100l混匀，室温避光20分钟。
7.溶血：每管加入溶血素2ml，室温避光10分钟。离心，1200转， 5分钟。弃上清。
8.破膜通透：每管加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟。加入2mlPBS，1000转，离心5分钟。弃上清。
9.胞内染色：加入IFN-gamma;或IgG1的抗体20l，混匀，室温避光30分钟。加入2ml PBS，1000转，离心5分钟，弃上清。
10.加入PBS 500l。上机前4度保存。
11.上机检测。
注意：本实验室可提供流式细胞检测服务或流式细胞仪,不会的新手可以自行上门观察.本实验室为正规三甲医院科研共享平台,所有开放的实验均为本实验最常规的技术服务,暂时开放的除了流式细胞术外还有荧光定量pcr,ChIP免疫沉淀,wester blot,细胞培养,细胞株.