流式细胞分析

实验概要

流式细胞分析是指通过对细胞进行免疫荧光染色，经过流式细胞仪分选荧光细胞或分析荧光细胞所占总体细胞的比例。流式细胞分析可以检测细胞周期分布、细胞亚群等，是一种强大的实验工具。
流式细胞分析操作过程视实验目的而定，下面以碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色法流式细胞技术分析细胞周期为例介绍。

实验原理

细胞DNA在细胞周期中会进行复制和分裂，随着细胞周期的进行，单个细胞中的DNA含量会发生相应的变化。PI可以插入DNA和RNA的碱基对中，使用时需用RNase处理细胞，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。通过流式细胞技术分析细胞群的PI的荧光分布，从而分析DNA含量的分布，进而分析细胞周期的分布。

主要试剂

0.25％Trypsin、细胞基础培养液、DPBS、70%酒精、5mg/mL RNase溶液、100μg/mLPI染液

主要设备

300目尼龙滤膜、15 mL离心管、流式管

实验步骤

（1）消化。从培养箱中拿出待染色的细胞，弃去培养液，用DPBS洗两次，接着用0.25％Trypsin消化4 min，用Trypsin2倍体积细胞基础培养液。收集细胞悬液至15 mL离心管，1000 r/min离心5min，弃上清。
（2）洗涤。用DPBS液洗一遍，1000 r/min离心5min，弃上清。
（3）固定。缓慢加入-20℃预冷的70%酒精7.5mL，冰浴30min（可以过夜，第二天染色）。
（4）PI单染。用移液器将固定的细胞吹散，用300目尼龙滤膜过滤，收集滤液在15 mL离心管中，1000 r/min离心5min，弃上清。加100μL 5mg/mL RNASE溶液，37℃孵育30min，然后冰浴终止酶作用。加100μg/mL PI染液，室温避光染色30min。之后可以根据细胞悬液的浓度适当补充细胞培养液或DPBS，用300目尼龙滤膜过滤，收集滤液到流式管中，随后进行流式细胞检测分析。
（5）根据PI的激发光波长为488nm，最大发射波长为610-620nm，来选择所需要的激光器和收集发射波的荧光通道，然后通过调节液路和光路，使得激发光正好打在液流上且聚焦良好。同时在计算机显示器上设置好程序并绘制好所需要的直方图。仪器状态和计算机显示器就绪后，将收集好滤液的流式管放到上样管位置，开始上样检测。流式不但能检测出荧光强度，同时还能时时的显示出各种荧光强度下的细胞数目。
（6）利用流式细胞仪测细胞周期。
图中横坐标显示的是荧光强度相关参数，纵坐标显示的是每个荧光强度所对应的细胞数目，图中可以清楚地显示出G1期，S期，G2/M期的峰，可以对各种荧光强度的细胞进行“设门”，可得到门内细胞数目、门内细胞的百分比、占检测细胞总数的百分比等，通过分析各峰的细胞百分比，得出处在各时期的细胞比例