流式细胞术的样品制备（七种样品的制备方法）（二）

四、外周血单个核细胞的制备

1．取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4ml，混匀；

2．将稀释后的血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液ficoll到液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰地分层状态；

3．离心2000r/min，30min，室温18~20℃，离心后可见试管内的血液清楚地分为4层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞处于血浆层和分离液层中间），底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层；

4．用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出收集到另1试管中，用生理盐水洗2遍，每次均以1500r/min，离心10min，弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液；

5．用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。

五、骨髓细胞单细胞悬液的制备

1．无菌抽取骨髓液0.5ml;

2．将骨髓标本滴入含1000U/ml肝素抗凝剂的1ml PBS液中；

3．再加入PBS液稀释至10ml；

4．用吸管吸取5ml稀释骨髓液徐徐加入盛有4ml的人类淋巴细胞分离液液面之上；

5．以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；

6．取有核细胞层，加入到10ml PBS液中，混匀；

7．以1000r/min离心5min，弃上清，收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。

六、单层培养细胞单细胞悬液的制备

1．弃去培养细胞(对数生长期)中的旧培养液，加入1～2ml 0．25％胰蛋白酶，倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，停止胰蛋白酶作用。也可直接观察培养瓶，静置消化2～3分钟，待细胞逐渐变白，有脱落趋势时，立即竖立培养瓶，停止胰蛋白酶作用，弃去胰蛋白酶；

2．加入3～4ml无钙离子和镁离子的PBS液，用吸管反复吹打，使其分散为单个细胞悬液，移人离心管中；

3．短时低速离心，即800~1000r/min，离心5min；

4．去掉上清液，加入5~8ml PBS液，低速短时离心，800~1000r/min，离心3~5min；重复2~3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片。

5．加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。

七、脱落细胞单细胞悬液的制备

在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为较好的单细胞悬液供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷检细胞等。

（一）食管拉网细胞的单细胞悬液的制备

1．将食管拉网器上的细胞洗脱到20ml PBS液中，以1500r/min离心后，再用PBS液洗2次，离心500~800r/min，1~2min，弃上清；

2．再加入PBS液5ml，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

3．加少许PBS液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。

（二）尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备

1．用以清洁器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h，轻轻倒去上清液，留下少许带细胞的沉淀物，用吸管移至10~20ml离心管中；

2．500r/min离心10min，去上清；

3．加PBS液8~10ml，以1000r/min离心10min，去上清，重复再洗1次；

4．再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

5．再加少许PBS液，混匀。加固定液或低温保存，备用。

（三）胸、腹水脱落细胞的制备

1．抽取胸、腹水50~100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清；

2．将底部10~20ml用长吸管移入试管中，用PBS液洗3次，以1500r/min离心沉淀5min；

3．再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

4．加少许PBS液，混匀；加固定液或低温保存，备用。

（四）冲洗液细胞样品的制备

1．用300~500ml生理盐水冲洗膀胱，冲洗一定时间后，吸出冲洗液放入容器中于冰箱内置6~12h；

2．取沉淀液20~40ml，离心沉淀并以生理盐水洗2次，吸上清；

3．加10ml PBS液，混匀，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

4．过滤后1000r/min，10min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。