流式细胞术的样本制备和实验设计

细胞来源和细胞悬液制备

全血标本：

1. 选择抗凝剂时要注意你要检测的抗原是否受抗凝剂中的组分影响？例如一些CD41抗体对EDTA非常敏感。

2. 裂解液的选择，可选择自配的氯化铵裂解液（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-178-1-1.html）或者商业化含固定成份的裂解液，但是要需要注意个别抗体可能会受裂解液中某种组分影响。大多数裂解液对所有种类的红细胞均有用，但某些病理性疾病标本或禽流感标本中有核红细胞可能很难裂解。

3. 血浆中是否存在干扰性物质。最典型的例子就是标记B细胞表面的免疫球蛋白，由于血浆中的Ig会影响抗体结合，所以需要事先用大体积的缓冲液洗涤至少3次。

PBMC：

全血标本用Ficoll密度梯度离心后提取出来的单个核细胞，包含淋巴细胞、单核细胞，可用于培养或直接分析。

缺点就是可能会丢失其中某些稀有细胞。

细胞株：

尽管细胞可能会处于不同周期，但细胞群比较同质。

从实体组织制备细胞悬液：

典型的标本是淋巴结、脾脏、肝脏等。

利用物理方法或者酶消化法（如胶原酶）制备。但是酶可能会破坏细胞表面抗原表达。

需要注意的是组织中有些细胞可能不能有效解离出来，例如免疫组化方法可发现脾脏中存在许多F4/80+的巨噬细胞，但在流式中很少看到。

标本处理

处理前注意几个问题：

1. 你要标记的抗原表达在细胞表面还是胞浆或胞核内？

2. 是分泌出来的分子吗？如果是，可能需要加用转运抑制剂（例如monensin或brefeldin A）。

3. 有些细胞表面抗原同时也有胞内位点，例如CD3、CD79a/b。

4. 胞内染色破膜有不同的试剂和方法，两步还是需要的，首先通过固定稳定细胞膜，然后利用去污剂给细胞膜打孔。自己配制可以用多聚甲醛固定、皂素破膜。

5. 染细胞核内的抗原需要再增加一步破核膜，例如使用甲醇。

6. 尽管4、5两步的试剂可以自配，但对于新手，建议还是购买商业化试剂。

7. 需进行表面染色和胞内染色，应该先进行表面染色。需注意有些制剂可能会影响特定荧光素结合，例如甲醇破核膜会影响细胞表面的PE染色。

对照的设置以及使信号最大化

需要注意区分真正的阳性和非特异性结合/自发荧光。

细胞阴性对照

显示细胞基准的荧光水平。

同型对照

选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，你检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果，很多站友在检测时出现的问题就是因为选择同型对照时没有同时符合以上4条原则。同型对照是为了查看抗体非特异性结合的水平。

FMO对照（荧光扣除对照）

用在多色实验中，辅助设置补偿，将方案中的抗体逐一减掉，以确保排除其它通道的荧光渗漏。

阳性对照

主要用来确保试剂的性能以及细胞活化状态。例如使用CD25或CD69检测活化。

死活细胞鉴别

记得每次检测都要用死细胞染料排除死细胞，因为死细胞自发荧光很高，会造成假阳性，让你的实验充满了未知数。

考虑阻断抗体

细胞染色前预先在与抗体同物种的血清中孵育，这种方法可用在直接染色也可用在间接染色。

Fc阻断

比上面用血清阻断更高级，小鼠抗体最常用的阻断抗体克隆是2.4G2。

滴定抗体

滴定抗体，既可以使您的抗体用量最有效，又可使结果最佳。抗体用量并不是越大越好，很多抗体用量增加后，阳性峰强度不增加，反而使阴性峰荧光增加。

染色体积

尽量用小体积染色。

孵育时间和温度

选择各异，有冰上孵育，有室温孵育的，结果都差不多。不过个别抗体可能会对条件比较敏感，那时候就需要进行比较了。

如何选择抗体

通用原则是，为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。

需要了解你使用的流式细胞仪性能如何，例如有哪些激光器、有哪些滤光片。

对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。