流式细胞术荧光那些事儿

自上世纪70年代问世以来，流式细胞术（FCM）在基础科研和临床诊断和治疗上得到了越来越广泛的应用。但是，做FCM往往会遇到荧光信号太弱的情况。好不容易搞了一管细胞去做流式，却做不出荧光信号。真的是急死个人。其实，毛博也是到米国做博士猴以后才开始做流式的。时间不算长。但是做得非常非常多。每天都要做好几次。什么五花八门的细胞和抗体都做过；什么匪夷所思的情况都碰到过。下面，毛博根据在米国做流式的经验教训，总结出了导致FCM荧光信号太弱的五个大坑，以及避免掉坑里的一些独门秘籍，都是血泪总结哟。

1. 荧光淬灭

如果抗体孵育时间太长，而又迟迟没有去做流式，荧光是会逐渐淬灭的。例如，直接染色法孵育时间是半个小时，而你12个小时后才去做流式，结果能好吗？解决办法只有一个，就是严格按照孵育时间，时间一到就去做，不能偷懒。那么，机器正好被人占了怎么办？毛博自己的经验是，把试管放在冰里面，可以稍稍延长淬灭的时间。毛博当年的实验室离流式细胞机房十万八千里，每次都是抱着冰桶屁颠屁颠跑过去的。生怕荧光淬灭！

2. 染色顺序

在进行多荧光染色的时候，由于不同抗体分子和荧光染料的特性不同，以及相应的抗原分子在细胞表面的分布不同，其染色顺序可能影响细胞的染色结果和细胞活性。即相同的细胞，由于染色顺序的原因，可能导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的样本，包括染色前样本，各种抗体和染料的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响，从中挑选出合适的染色方案。

3. 染色方案

很多时候，荧光染色信号太弱，是由于染色方案不合理造成的。解决的方案同上：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。要考虑使用什么试剂，试剂质量，试剂用量，孵育时间以及洗涤次数等等多方面的因素。染料的浓度，染色时间，染色温度要求都很严格，不同物种，不同组织的细胞染色时间也略有不同。最终目的是使所设计的方案背景荧光尽量小，特异性染色荧光尽量强。

4. 激发光

不同的抗原，其激发光的波长是不一样的。如果选择了不合适的波长，也会造成荧光信号太弱的问题。解决方案很简单：就是严格按照抗原选择合适的波长。不要想当然地瞎选。下面是一个例子：

5. 样本的背景信号过高

有时候细胞悬液里面有很多的细胞碎片和死细胞，造成样本的背景信号很高，掩盖了我们真正需要的荧光信号。为了更加灵敏地检测细胞，就需要在散射光FSC设定合适的阈值，低于FSC阈值的信号不被检测，高于FSC阈值的信号才能被检测，其目的是去除大量的背景信号。通过设定合适的阈值就可以有效地排除死细胞和碎片的干扰，剩下的主要是白细胞的信号，从中可以初步看出存在不同的亚群。

下图是一个红细胞裂解得很好的血液样本，设定合适的阈值排除了所有的背景信号，余下的全部是白细胞的信号：

图中可以很清晰地分辨出白细胞的不同亚群，分选这三个不同亚群的细胞，在显微镜下观察确认这群细胞：FSC和SSC均较小的一群细胞，染成红色的，是淋巴细胞；FSC和SSC均较大的一群细胞，染成蓝色的，是中性粒细胞；FSC和SSC适中，染成绿色的是单核细胞。而最下面那些灰色的，就是被排除了的细胞碎片和死细胞。

其实，做FCM还是挺好玩的。现在已经可以同时做13种颜色了。毛博在米国的时候，最多做过同时分析4种颜色的。看着显示屏上面五颜六色的细胞，特别是得出自己理想的结果的时候，还是挺有成就感的。以上毛博介绍了自己做FCM的一些体会心得，希望对大家有所帮助。