流式细胞术间接免疫荧光标记的样品制备实验

实验样品

抗体、PBS溶液

移液器 移液吸头 离心机

一、不同来源样品的处理

1 . 培养细胞

（1）培养细胞用0.25%的胰酶消化。

（2）PBS或生理盐水洗涤细胞2次，再用PBS或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为60%——70% ，快速混匀，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。

2. 新鲜标本

（1）将标本切成1——2mm³的小块。

（2）PBS或生理盐水清洗后去除上清，加入0.2％胶原酶（或0.15％胰蛋白酶）37℃消化10——30min（根据实验及不同组织确定），并不断振动。

（3）300目尼龙筛过滤，除去组织团块，PBS洗涤2次，300g离心5min，获得已消化的细胞。

3. 石蜡包埋标本

（1）标本在切片机上切取3——5片50μm厚的组织片。

（2）将切片彻底脱蜡，梯度乙醇（100％、95％、70％）及蒸馏水水化。

（3）0.5％胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃消化30min，每隔10min振动1次。

（4）300目尼龙筛过滤，获得的细胞悬液PBS洗涤2次，300xg离心5min。

注意：脱蜡一定要完全（若加入100％乙醇无絮状物飘起即可）；切片厚薄适宜，太薄碎片多，影响FCM分析结果，太厚易造成脱蜡不净；注意掌握消化时间，避免已释放的细胞被消化。

二、制备

1. 取1×10⁶个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30min。

2. 用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液（离心转数一般为800——1000rpm，5min）。

3. 用100μl PBS重悬细胞，再加入FITC或PE标记荧光二抗（用量均按说明书要求加入）混匀，室温下反应30min。

4. 用PBS再洗涤细胞2次，加入500μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。

1. 以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间，一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。

2. 制备好的样品，若不能及时上机检测，用1%——4%的多聚甲醛固定，4℃下可保存5天。

此法由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。此外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。