流式细胞计的调试和使用

(1)调试和校准：流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。

激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。

液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节　气体压力大小以获得稳定的液流速度。

测量区光路调节　：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90。散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。

流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好，且经济、容易获得。常用标准荧光微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。微球用树脂材料制作，或标有荧光素，或不标记荧光素。Flow Cytometry Stands公司可提供荧光强度药盒，在免疫实验中可用来作为定

荧光标准来测定每个细胞所标记的抗原位点数目。所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下：取3.8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血(抗凝剂：鸡血=1：4)，经PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化24h，最后经PBS再清洗，贮4℃冰箱中备用。需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。

(2)仪器的操作和使用：

①打开电源，对系统进行预热;

②打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度;开启光源冷却系统;

③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统;

④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0。和90。散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小;

⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品;同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程;

⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统;

⑦因为实验数据已存入计算机硬盘(有的机器还备有光盘系统，存贮量更大)，因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理;

⑧将所需结果打印出来。

在操作和使用中一定要注意如下事项：

1)光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作;另外还要注意磁屏蔽;

2)光源不得在短时间内(一般要1h左右)关上又打开;使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常;

3)液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒;

4)注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等;

5)特别强度每次测量都需要对照组。