浅析重组蛋白纯化中样品的预处理

样品预处理也称为样品前处理，是指消除干扰因素完全保留被测成份，并使被测成份浓缩，以获得可靠的分析结果。在重组蛋白纯化实验中，首先要对不同来源的材料进行预处理，样品预处理的目的主要有除去微粒、减少干扰杂质、浓缩微量组分、提高检测灵敏度及选择性、改善分离效果、有利于色谱柱和仪器的保护等。因此样品处理技术就成为提高分析测定效率、改善和优化色谱分析的重要环节。

自90 年代以来,基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占全部成本的60%～80%，因此重组蛋白纯化技术越来越重要。美迪西生物医药是一家医药研发外包公司，在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富，其拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术。

1、样品预处理是重组蛋白纯化的重要步骤，常采用的技术有

（1）溶剂提取法

同一溶剂中，不同物质具有不同的溶解度。利用混合物中各物质溶解度的不同将混合物组分完全或部分分离的过程称为萃取，也称提取，常采用浸泡法或溶剂萃取法。

（2）盐析法

向溶液中加入某种无机盐，使溶质在原溶剂中的溶解度大大降低，而从溶液中沉淀析出，这种方法叫做盐析。如在蛋白质溶液中加入大量的盐类(硫酸铵)，特别是加入重金属盐，使蛋白质从溶液中沉淀出来。

在进行盐析工作时，应注意溶液中所加入的物质的选择，它应是不会破坏溶液中所要析出的物质，否则达不到盐析提取的目的。

（3）化学分离法

如色层分离法、沉淀分离法、磺化法和皂化法、掩蔽法等。

（4）浓缩法

食品样品经提取、净化后，有时净化液的体积较大，被测组分的浓度太低，会影响最后结果的测定，此时需要对被测样液进行浓缩，以提高被测成分的浓度。常用的方法有常压浓缩和减压浓缩两种：

2、样品预处理诱导方式的选择

在诱导方式的选择上，为了得到正确折叠的目的蛋白，要考虑表达菌种的生长情况、菌种是否健壮、是否是单克隆菌种、菌体的浓度是否适合诱导等。生长状态不好的表达菌，一方面会造成目的蛋白的错误折叠，造成蛋白大小、形态等发生改变，另一方面会因为诱导剂IPTG的加入，导致菌体的死亡或者降解。

低温度诱导有助于蛋白二硫键的正确折叠，但对于高温表达的蛋白不适合低温状态，温度过高容易导致包涵体的形成。

3、选择合适的诱导剂

基因的诱导表达基于乳糖操纵子调节机制，没有乳糖存在的时候，阻碍物基因产生阻碍蛋白，阻碍蛋白和操纵子结合，抑制基因的表达；当有乳糖存在的时候，B-半乳糖苷酶和乳糖作用产生异半乳糖，异半乳糖和阻碍蛋白结合，解除抑制、激活基因，开始表达蛋白。诱导的浓度的高低对目的蛋白的表达也会产生影响。

4、抽提方式

进行破壁之前应该选择合适的缓冲组分，合适的pH 要结合酸碱溶液的滴定调节，尽量低的离子强度，加入一些稳定成分稳定成分，EDTA螯合重金属离子，表面活性剂，保护非极性表面等。

5.确定蛋白质样品的形态，浓度、黏度、体积。

有时候得到粗蛋白的时候，会观察是否符合目的蛋白的一些性质，确保得到是目标蛋白。粗蛋白的形态有没有明显的差异，浓度是否符合纯化的要求，是否有较多的干扰物质等。

6.优化表达条件

（1）重组蛋白不表达或者表达量低。

如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有）通过改变诱导剂浓度、诱导温度、时间等都不表达的时候，然后尝试更换菌株、质粒载体。

降低诱导后培养温度，重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达。

减少诱导剂，诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时，减少诱导剂的效果更好。

（2）检查密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好

稀有密码子，尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子，会降低mRNA稳定性，显著降低翻译速度，引起翻译提前中止、翻译移码和突变。将这些稀有密码子（尤其是N端）突变为宿主偏好的密码子，能够显著提高表达水平，改善蛋白稳定性。

处理高毒性蛋白：毒性极高的重组蛋白，其本底表达就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高表达，采用可表达T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量，在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。

（3）包涵体表达

包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等，即使包涵体蛋白成功复性，其均一性和活性依然备受质疑。但是包涵体表达也有其优势：能够很轻松的获得超高的表达量，不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解，重组蛋白的毒性被大大抑制，杂蛋白含量低容易纯化等。

由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展，表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受，成为重组蛋白表达的一个常用方案。