放射性标记DNA探针的制备
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。
l DNA的标记
1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5’凸出末端。酶切体系终体积50μl，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应1小时。
2．向酶切反应混合液中加入
[α－32P]dATP（约10μCi/μl）(若5’凸末端含T残基) 10μl
dCTP(2mmol/L) 1μl
dGTP(2mmol/L) 1μl
dTTP(2mmol/L) 1μl
DNA聚合酶（Klenow片段）（5单位/μl） 1μl
室温温育反应体系30分钟。
3．加入7μl 10×上样缓冲液终止反应。
l 标记探针的分离
1．将反应混合物上样于非变性凝胶。
2．10～15V/cm条件下，用0.5×TBE缓冲液电泳2～3小时。
3．将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。
4．将凝胶室温下对X光片曝光1分钟。小心操作使得显像后的X光片与凝胶能以曝光时方位复原。
5．用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记DNA片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片（约1mm2）后，放入微量离心管中。
6．向管中加入1ml洗脱缓冲液，37℃连续振荡，温育过夜。
7．将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管500μl），然后各加入1ml 100％乙醇，－80℃放置10分钟。室温离心15分钟沉淀DNA。
8．弃上清，用80％乙醇洗沉淀，室温离心5分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。
9．用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量TE中使标记探针的浓度为约104cpm/μl。
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蛋白质与DNA结合反应 l 聚丙烯酰胺凝胶的制备 1．按（三）中步骤灌制一块5％非变性聚丙烯酰胺凝胶，用10×TGE缓冲液配制成终浓度为1×TGE的凝胶。 l 结合反应 1．按下表中试验设计加样建立结合反应。向各个反应体系中加入蛋白提取物启始反应，温和吹吸或轻叩管底混匀反应物。 管号 DNA探针 （μl） poly(dI-dC)•poly(dI-dC) （μl） 10×BB （μl） H2O （μl） 蛋白抽提液 （μl） 1 1 2 3 24 0 2 1 2 3 23 1 3 1 2 3 21 3 4 1 2 3 19 5 5 1 2 3 14 10 6 1 0 3 22 4 7 1 0.5 3 21.5 4 8 1 1 3 21 4 9 1 3 3 19 4 10 1 3 3 17 4 2．室温温育结合反应体系30分钟。 3．向每个样品中加入3μl上样缓冲液后混匀，上样于5％非变性聚丙烯酰胺凝胶。 4．
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