液相法筛选cDNA表达文库中RNA结合蛋白实验

实验方法原理 将 cDNA 文库表达的蛋白固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后用标记的 RNA 对其进行筛选的方法是筛选 RNA 结合蛋白研究中最常用的技术。

实验材料 TY

试剂、试剂盒 储存液溶菌酶干粉细菌裂解缓冲液甘油水溶液

实验步骤

一、材料与设备

1. 2X TY：16 g 蛋白胨，10 g 酵母提取物，5 g NaCl，水定容至 1 L，高压灭菌。

2. 储存液：1 mol/L IPTG；1 mol/L DTT；100 mmol/L PMSF( 用无水异丙醇配制）；均分装后 -20℃ 保存。

3. 溶菌酶干粉，-20℃ 保存。

4. 细菌裂解缓冲液：150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA，1% NP-40（或 Igepal-630），4℃ 保存。用前取 10 ml 置于冰浴，加 10 μl 1 mol/L DTT、100 μl 100 mmol/L PMSF 和约 20 mg 溶菌酶。

5. 40% 甘油水溶液，高压灭菌后 4℃ 保存。

二、操作方法

1. 将质粒 cDNA 表达文库转化到大肠杆菌，在含抗生素的培养液中 37℃ 振摇培养直至 OD600 达 0.5~1.0，4℃ 保存培养产物。临用前取出一部分逐级稀释后涂板，计克隆数并计算文库滴度。

2. 在培养管内加 2 ml 含抗生素的 2X TY，每管接种 250 个细菌克隆，37℃ 振摇培养直至 OD600 达 0.5。

3. 10 mmol/L IFTG 诱导表达 lacZ 融合蛋白，37℃ 振摇培养 3 h 或过夜。

4. 将培养物标号，取 1.5 ml 14000 g 室温离心 1 min 收集，其余 0.5 ml 于 4°C 保存。

5. 将离心获取的细菌置于冰上，用细菌裂解缓冲液重悬，冰浴 30 min。

6. 14000 g，4℃ 离心 15 min。同时取干净离心管置于冰浴，标好号后各加 20 μl 40% 甘油；将离心后的样品管同样置于冰浴，从中取 20 μl 上清加入含甘油的干净的离心管内，吹打混匀，即获得含有 cDNA 文库蛋白的细菌提取物。

7. 将细菌提取物立即用干冰/乙醇或液氮速冻，-70°C 保存。（用时冰浴化开，再保存时同样先用干冰/乙醇或液氮速冻再置于 -70℃。）

8. 用结合位点探针对提取物进行检测（gel-shift 或 UV 交联法）。如果收集的提取物中有 RNA 结合活性，再用阴性对照探针和所研究的 RNA 探针共同检测此 RNA 结合活性的特异性。

9. 对于提取物中具有 RNA 结合活性的样品，根据标号找到对应的、保存于的其余 0.5 ml 细菌培养产物，计数样品滴度；接种 40 个培养管，每管 25 个细菌克隆，37℃ 振摇培养直至 OD600 达 0.5。

10. 重复步骤 (3)~(9)。一旦某一管中的细菌蛋白提取物被证明具有 RNA 结合活性，就将对应标号细菌培养样品涂板以获取单一克隆，再接种 20 个培养管，每管 5 个克隆细菌；重复步骤 (3)~(9)；最后一轮筛选，接种 20 个培养管，每管仅含 1 个克隆。