液相色谱微型化：我们为什么这样做？（三）

下一个例子是毛细管级液相色谱在目标定量工作流程中的应用。在本例中，选择毛细管级液相色谱来增加通量、提高耐用性和易用性，同时保持很高的灵敏度。在内径为300 μm 的色谱柱上分离出添加同位素标记肽的酵母消化物。样品在30 分钟内以流速4μL/min 被分离，并连接到采用标准HESI-II 接口的Thermo Scientific^TM TSQ Vantage^TM 三重四极杆质谱仪，在SRM 模式下进行检测，检测限达到10 amol（图5）。更多详情可参阅Thermo Scientific 的应用报告583。³

图5. 按不同浓度向500 ng 酵母消化物基质中加入肽SAAGAFGPELSR 的提取色谱图

以下微流速示例对生物制药行业中高效率和高通量肽谱图匹配应用特别适用。在这个特定例子中，首先以6 μL/min 流速通过30 分钟梯度洗脱分离单克隆抗体消化物。在两个连续步骤中，流速升高至15μL/min，同时梯度缩短。图6 显示了在不降低数据质量的情况下分析时间如何缩短到1/3。以类似的方式提高标准粒径填料液相色谱柱上的流速，可能会使色谱系统与质谱仪的连接变得复杂，并需要每日更换两次流动相。

图6. 在300 μm（内径）×15 cm 的 Thermo Scientific^TM Acclaim^TM PepMap^TM RSLC 分析柱上加速分析单克隆抗体Lys C 消化物

最后，Xiang He 等人展示了微流速液相色谱在法医毒理学等领域取得的可喜成果。4 建立了简便、高灵敏的方法，可量化分析生物样品中的大麻素，满足法医毒理学的需要。这种方法在设计和循环时间上与典型的标准粒径填料应用类似，但灵敏度更高，可以分析进一步稀释的样品。法医毒理学者可将这种多用途的工作流程应用于其他常见的非法/ 滥用药物定量分析。试剂的消耗量也会显著降低90％以上，并降低质谱仪的维护频率。

结论

液相色谱仪的微型化通常仅被认为与蛋白质组学研究所要求的可提供更高灵敏度的纳升级液相色谱相关。但是，毛细管级和微流速液相色谱已大幅度提高了灵敏度。此外，在整个流速范围内（从纳升级到传统规格），可以保证UHPLC 的能力，大大简化了分析的规模，而且不会影响到性能。

虽然蛋白质组学仍是纳升级液相色谱应用的主要焦点，但在生物制药和法医/ 毒理学应用方面亦有很多潜力。如前所述，用户使用微型化液相色谱不但能提高灵敏度，而且更轻松地与质谱连接，同时还大幅降低了样品和溶剂的消耗量。这不但补偿了延长的操作时间，还降低了操作成本。切换到毛细管级液相色谱或微流速液相色谱意味着灵敏度和耐用性、通量和易用性之间达到完美平衡。

所以重新回到标题中的问题：“液相色谱仪的微型化; 为什么我们这样做呢？”，因为有很多裨益！

参考文献

1. Rieux, L.; Sneekes, E-J.; Swart, R. Nano LC: Principles, Evolution, and State-of-the-Art of the Technique. LCGC NA2011, 29 (10), 926–934, [Online] http://www.chromatographyonline. com/lcgc/ Column%3A+Innovations+in+HPLC/Nano-LC-Principles-Evolution-and-State-of-the- Art

/ArticleStandard/Article/detail/745381 (accessed August 7,2013).

2. Köcher, T.; Swart, R.; Mechtler, K. Anal. Chem. 2011, 83, 2699–2704.

3. Kiyonami, R.; Swart, R; Zabrouskov, V.; Huhmer, A. Increased Robustness and Throughput for Targeted Protein Quantification Using Capillary Flow and a Conventional ESI Probe, Thermo Scientific Application Note 583, [Online] http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/techres ource

resourceId=102334&storeId=11152&from=search# (accessed August 7, 2013).

4. He, X.; Kozak, M.; Nimkar, S. Anal. Chem. 2012, 84 (18), 7643–7647.