液相色谱微型化：我们为什么这样做？（二）

纳升级、毛细管级和微流液相色谱的超高效液相色谱仪 (UHPLC)

计算得出的灵敏度增量实际上是常规和微型化液相色谱应用之间的比例因子，而流速是最好的例子。通常情况下，常规液相色谱中的流速（内径为4.6 mm）为1000-1200μL/min，纳升级液相色谱（内径为75μm）为0.250-0.300μL/min。4000 的比率反映内径为4.6 mm 的色谱柱与纳升级液相色谱柱之间的比例因子，并将导致两个色谱柱的线性速度（大致）相同。

Thermo Scientific^TM Dionex^TM UltiMate^TM 3000 RSLCnano 系统（图3）旨在为现代纳升液相色谱提供所需的非常低的流速和非常高的压力。UltiMate 3000 RSLCnano 系统在UHPLC 压力条件下，提供的流速可低至20 nL/min*、高至50μL/min，使其成为可实现纳升级、毛细管级和微流速液相色谱分析的完美仪器。1 模块具有内置柱温箱，可支持一系列应用，同时可最大限度地缩短各种元件之间的物理距离。这可使连接管尽可能地缩短。

连接管的另一个重要方面是管路内径。纳升级液相色谱 (20 μm) 的连接管内径大约比常规管路内径小10 倍。通常，毛细管级和微流速液相色谱分别采用内径为50μm 和 75 μm 的连接管。

如果正确连接合适的管路，就会得到最好的结果。Thermo Scientific^TM Dionex^TM nanoViper^TM 接头系统可提供厂制、手紧UHPLC 接头，零死体积。nanoViper 接头和连接管及色谱柱集于一体，无需工具即可组装，且没有引入死体积或连接时毛细管断裂的风险。

* 要求时才会提供最低流速

图3. UltiMate 3000 RSLCnano 系统、内视图和nanoViper 接头

微型化液相色谱 - 应用领域

微型化液相色谱通常可分为三类或三种流速范围：纳升级、毛细管级和微流速液相色谱。纳升级液相色谱是指流速低于1000 nL/min的应用，毛细管级液相色谱包含低流速范围 (1–10 μL/min) 的应用，而微流速液相色谱涵盖流速超过10 μL/min 的应用。

以下是各流速范围的典型应用示例。第一个也是最常见的示例，纳升级液相色谱应用于蛋白质组学发现工作流程中。在这里，样品量的限制是使用纳升级液相色谱的主要原因。在第二个例子中，毛细管级液相色谱被应用于复杂基质中目标肽的定量分析。样品可能较易得到，但通量也很关键，毛细管级液相色谱可做到二者兼顾。对于第三个示例，微流速液相色谱被用来提高单克隆抗体 (MAb) 消化物分析中的通量。在这里，样品量不再是限制因素，但增加的灵敏度和系统耐用性很有价值。最后，给出一个非生物分析的例子。

在蛋白质组学研究中，研究人员面临着双重挑战。待研究的蛋白质浓度低且样品体积小，导致含量极低。此外，样品非常复杂。这些因素促使开发出纳升级液相色谱系统和具有非常高分离能力的色谱柱，确保特殊应用，如图4 所示。科赫尔 (Köcher) 等人进行了类似的实验，他们通过在 50 cm 的色谱柱上进行8 小时梯度洗脱，从而在胰蛋白酶消化的HeLa 细胞中平均鉴别出2516个蛋白质。²

图4. 在75 μm（内径）×50 cm 的纳升级液相色谱柱上经10 小时梯度洗脱后高分辨率分离的大肠杆菌消化物