液相色谱（HPLC）入门（二）

什么是色谱图?

色谱图表示发生在高效液相色谱系统中的化学[色谱]分离。一系列从基线出现的峰以时间为坐标。每个峰代表对不同化合物的检测器反应。色谱图由计算机数据站描绘。[如图 H].

Figure H: How Peaks Are Created

图H中，黄色谱带完全通过了检测器流通池；产生的电信号被送到计算机数据站。得到的色谱图逐渐出现在屏幕上。请注意从进样开始，色谱图就在屏幕底部形成直线。这条直线称为基线，它代表随时间变化，纯流动相通过流通池。随着黄色分析物谱带穿过流通池，一个较强信号被传送到计算机。这条曲线，开始是上升，之后下降，和样品谱带中的黄色染料的浓度成正比。这就形成了色谱峰。当黄色谱带完全流出检测器的流通池，信号强度回到基线水平，而流通池现在又一次，只有流动相。由于黄色谱带流动最快，首先从色谱柱洗脱出来，所以这是第一个峰。之后，一个红色谱带到达流通池。从红色谱带进入流通池开始，信号从基线抬起来，代表红色谱带的色谱峰被划出来。在本图中，红色谱带还没有完全通过流通池。图中所示是如果我们此刻停止该过程，红色谱带和红色色谱峰的样子。由于红色谱带的大部分已经通过了流通池，色谱峰的大部分已经被划出来，如实线所示。如果我们能再开始，红色谱带能完全通过流通池[虚线]。最强保留的蓝色谱带流速最低，在红色谱带之后流出。虚线表示如果我们连续完成，一个完整的色谱图如何出现。有意思的是蓝色峰的宽度将是最宽的，而蓝色分析物谱带的宽度在柱子上、是最窄的，而从柱中流出时变得最宽。这是因为它在色谱柱填料床中移动较慢，需要较多时间[和流动相体积]才被完全洗脱出来。由于流动相在一个固定的速度下移动，这意味着蓝色谱带展宽和变稀。由于检测器的反应与谱带的浓度成正比，因此蓝色峰高较低，而宽度较大。

定性和定量化合物

图H中，三个时间上分开的色谱峰代表三个染料化合物。每一个洗脱物在一个特定的位置，时间段计算从进样[零时]到峰最高点洗脱出来为止。比较每个峰的保留时间[tR]和注入同一色谱系统的标准物质[相同流动相和固定相]的保留时间，色谱工作者就可能鉴定每一个化合物。

图 I -1 中出示的色谱图，色谱学家已经知道，在设定的液相条件下，分析物丙烯酰胺可以被分离并在2.85分钟[保留时间]从柱中洗脱下来。当任何一个新样品含有丙烯酰胺时，在相同的液相条件下，都会在2.85分钟出现色谱峰[如图 I -2 种样品 B]。当鉴定完成后，下一个重要的信息是样品中每一个化合物的含量是多少。来自检测器的色谱图和相应数据帮助我们计算每种化合物的浓度。检测器基本上反映化合物谱带通过流通池的浓度。浓度越高，信号越强，这可从基线上色谱峰高度观察到。

Figure I-2: Identification and Quantitation

图 I-2中，样品A和B的色谱图，在同一时间段相互重叠。两个样品的进样体积是一样的。两张色谱图在保留时间[tR] 2.85 分钟时都出现了一个色谱峰，表明每个样品都含有丙烯酰胺。然而，样品A显示出一个明显变大的丙烯酰胺峰。峰下面的面积[峰面积计算]是测量化合物浓度的一种方法。峰面积数值是由计算机数据站自动积分和计算。在这个例子中，样品A中丙烯酰胺的峰面积是样品 B 中的十倍。利用标准样品对比，可以推断样品 A 含有 10 pg 丙烯酰胺，是样品 B 中丙烯酰胺含量的十倍[1 pg]。注意另外一个峰[没有鉴定] 在两个样品中的洗脱时间都是 1.8 分钟。由于峰面积在两个样品中大致相同，因此这个未知化合物可能在两个样品中含量相同。

等度和梯度液相系统操作

高效液相色谱使用两种基本的洗脱模式。第一种称为等度洗脱。在这种模式下，流动相，无论是纯溶剂或混合物，在整个操作过程中保持不变。一个典型的系统如图J-1所示。

第二种称为梯度洗脱，正如名称所指，流动相的组成在分离过程中发生变化。这种模式对含有多种不同色谱极性化合物的样品非常有用[参见"高效液相色谱分离模式"]。随着分离的进行，流动相的洗脱强度逐渐增强以洗脱出更强保留的样品组分。

最简单的一个例子，如图 J-2 所示，有两个溶剂瓶和两个泵。每个泵的流速由梯度控制器管理，在分离过程中传输或多或少的溶剂。两种溶剂在混合器中混匀形成实际流动相，再传输到色谱柱上。起始阶段，流动相含有大比例的弱溶剂[溶剂 A]。一段时间以后，强溶剂[溶剂 B]的比例增加。注意图 J-2中，混合器是两个泵的下游，因此，梯度是在高压下产生的。另一种高效液相色谱系统可设计为在泵前低压条件下混合多种溶剂。一个梯度比例阀从四个溶剂瓶之间选择溶剂，随时间改变流动相强度[如图 J -3]。