淋巴细胞的分离和激化实验

实验试剂

1. PBS（Dulbecco）：
   0.10g/L 无水CaCl₂
   0.20g/L KCl
   0.20g/L KHPO₄
   0.10g/L MgCl₂.6H₂O
   8.00g/L NaCl
   2.16g/L NaH₂PO₄.7H₂O
   调pH至7.4

2. 生长培养基：
   不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基
   10% FBS
   庆大霉素（可不用）（10μg/ml）
   2mmol/L L-谷氨酰胺
   1mmol/L 丙酮酸钠

3. 促细胞分裂剂（终浓度）
   5μg/ml PHA：1mg/ml母液-20℃分装冻存
   25μg/ml 刀豆凝集素A（conA）：0.4mg/ml母液-20℃分装冻存
   商陆促分裂原：再水华母液-20℃分装冻存

实验步骤

1. 收集10ml全血，加入不含防腐剂的肝素（0.2ml肝素/10ml全血）。实验全过程保持无菌操作。
2. 在15ml离心管中的肝素化血中加入1ml 6%葡萄糖，室温放置20~30min，沉降红细胞。沉降时间不宜过长，否则单核细胞将不再保留在富含白细胞的血浆。
3. 从葡聚糖处理的血中小心收集红细胞上层的富含白细胞的血浆。
4. 富含白细胞的血浆室温300g离心8min，沉淀细胞。
5. 弃上清，细胞轻悬于1ml PBS中。
6. 于室温下，用无菌巴斯德吸管小心将细胞悬液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技术熟练，才能保持血浆曾在Ficoll-Hypaque层之间界面清晰。
7. 400g低温（4℃）离心30min，沉淀细胞。离心后切记不要破坏管中的分层。
8. 淋巴细胞在血浆和Ficoll-Hypaque层之间的白色浑浊条带中，小心取出贮存，弃红细胞沉淀。
9. 5ml PBS洗一次细胞，室温250g离心5min，沉淀细胞悬于3~5ml生长培养基中。
10. 全部细胞悬液转移至T25组织培养瓶，加促细胞分裂剂。