淋巴细胞增殖功能的测定实验

PBMC

闪烁液 RPMI1640 CO2孵箱

细胞收集仪 β液闪仪

1.  无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞（PBMC）洗涤后用10％FCS RPMI1640调整细胞数为1～2x10⁶/ml

　　　　　　
2.  加入96 孔培养板中，1～2x10⁵ 细胞/100 ul/孔，每组设3孔。加入最适剂量PHA，100 ul/孔，同时设不加PHA阴性对照。如观察细胞因子（如IL-2）或其它刺激物（PMA）对增殖功能的调节作用，则根据加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200 ul，37 ℃、5 ％ CO2孵育，66 h

　　　　　　　　
3.  每孔加入0.5～1 uci　3H-TdR（50ul），继续培养6～12 h

　　　　　　　　　
4.  用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上

　　　　　　　　　　　　
5.  烤干后β液闪仪计数

　　
6.  计算
 

（1）增殖水平直接用CPM值表示。

（2）也可用刺激指数（SI）表示
 

　　PHA（或实验组）cpm-机器本底

SI＝───────────────

　　阴性对照组cpm-机器本底

1.  注意无菌操作。

　　
2.  PHA、ConA、PWM、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别，如Wellcome公司PHA终浓度最适剂量为1～3 ug/ml，而广州医工所PHA约为20～100 ug/ml。

　　
3.  根据实验需要，对不同种（人、小鼠、大鼠、兔、狗等）不同来源淋巴细胞（胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等）均应进行最适细胞浓度、圈养时间和刺激物浓度的摸索。

来源：医学基础免疫学实验指导，主编金伯泉李恩善，第1 版，北京：世界图书出版社，1990