淋巴细胞增殖功能的测定实验

实验方法原理 T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3 McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现，integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用PHA刺激PBMC，根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入率测定T细胞的增殖水平。

实验材料 PBMC

试剂、试剂盒 闪烁液RPMI1640CO2孵箱

仪器、耗材 细胞收集仪β液闪仪

实验步骤

1.  无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞（PBMC）洗涤后用10％FCS RPMI1640调整细胞数为1～2×106 /ml

2.  加入96 孔培养板中，1～2×105 细胞/100 μl/孔，每组设3孔。加入最适剂量PHA，100 μl/孔，同时设不加PHA阴性对照。如观察细胞因子（如IL-2）或其它刺激物（PMA）对增殖功能的调节作用，则根据加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200 μl，37 ℃、5 ％ CO2孵育，66 h

3.  每孔加入0.5～1 μci　3H-TdR（50μl），继续培养6～12 h

4.  用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上

5.  烤干后β液闪仪计数

6.  计算

（1）增殖水平直接用CPM值表示。

（2）也可用刺激指数（SI）表示

　　PHA（或实验组）cpm-机器本底

SI＝───────────────

　　阴性对照组cpm-机器本底

注意事项

1.  注意无菌操作。

2.  PHA、ConA、PWM、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别，如Wellcome公司PHA终浓度最适剂量为1～3 μg/ml，而广州医工所PHA约为20～100 μg/ml。

3.  根据实验需要，对不同种（人、小鼠、大鼠、兔、狗等）不同来源淋巴细胞（胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等）均应进行最适细胞浓度、圈养时间和刺激物浓度的摸索。