溶菌酶（lysozyme）的制备及其性质实验原理和操作(1)

【实验内容】
1.溶菌酶Y活性检测
⑴ 酶活力测定方法
⑵ 酶活力单位定义
⑶ 比活力定义
⑷ 蛋白含量测定方法
2. 蛋清溶菌酶的提取
⑴ 每组4～5个新鲜鸡蛋
⑵ 利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取
3. 溶菌酶的分离、纯化
⑴ 利用各种方法，从上述提取液分离
⑵ 每步纯化前蛋白纯度检测
⑶ 分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性
4. 溶菌酶理化性质
⑴ 溶菌酶的分子量测定
⑵ 溶菌酶的等电点测定
5. 溶菌酶的酶学性质
⑴ 在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km
⑵ 初步确定溶菌酶的最适pH
⑶ 初步确定溶菌酶的最适温度
⑷ 提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型
⑸ 提出溶菌酶的激活性并验证
(6) 溶菌酶的热稳定性

【实验原理】
溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为 1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N- 乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数 为 13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE 鉴定为一条带。采用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。

【实验材料】
1.实验器材
循环水式真空泵HSB-IⅡ; 蛋白紫外检测仪; 记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器(500mL); 721型光分光光度计; 冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶 (1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL)
2．实验试剂
⑴ 鸡蛋清（鲜鸡蛋）
⑵ 底物微球菌粉
⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂
⑷ 固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）；固体磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4）
⑸ 乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮
(6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50
⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸
⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂;蛋白含量测定（福林法）试剂
⑼ 聚乙二醇-20000、两性电解质
【实验操作】
1.蛋清的制备
将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH 值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml。