激光共聚焦显微镜样品制备方法

组织的采集、固定和保存

不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛( PFA) 固定法。

液氮冷冻法:采取新鲜组织后，即可放入液氮中保存。

多聚甲醛固定法:小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和 4% PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于1cm ×1cm ×1cm，置于4% PFA 中进行后固定，后固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以 4 ℃固定过夜，或室温1~4h。之后，用0.01mol /LPBS缓冲液洗 3 次，每次10~30min 。在20% 蔗 糖中4 ℃ 浸泡1h 以上，待组织块下沉后，即可进行冷冻切片。组织块可置于4 ℃ 冰箱保存于20% 蔗糖( 含 0. 05% NaN3) 中，一个月内完成切片。表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。有些组织样品，如小型实验动物胚胎以及需同时采集样品进行 DNA 、蛋白质提取时，可根据实验情况和条件采集新鲜组织，直接进行化学试剂固定。实验室通常配制10% PFA 储液，称取 10g 多聚甲醛 ( SIGMA，Produce No. : P6148 ) 粉末，置 于250 mL 锥形瓶中，加入80 mL0. 01 mol / LPBS，再加入5~6滴10NNaOH，于65℃水浴中溶解3~4h，待完全溶解后冷却至室温，调 pH 值至 7.4，溶液定容至 100 mL，过滤后分装成每管 4 mL 或 8 mL，保存于 - 20 ℃ 。使用前将储液置于 80 ℃ 水浴中融化，用0.01mol/LPBS稀释至4%，即可使用。(4%PFA工作液配好后可以4℃密闭保存，24h内使用。)