牛结核血清抗体用Dot－IGSS检测步骤

（一）材料与试剂

1．抗原  牛结核PPD。

2．血清  待检血清、标准结核阳性血清和结核阴性血清。

3．硝酸纤维膜  孔径0.45µm。

4．氯化金（优质）

5．0.2Mol/L PB液

6．0.05Mol/L Tris—HCl缓冲液

7．硝酸银显影液（现用现配）

   明胶（20g/L）                   6.00ml

   对苯二酚（57.90g/L）            3.00ml

   硝酸银（25g/L）                 0.20ml

   pH3.5柠檬酸盐缓冲液             1.00ml

   对苯二酚和硝酸银溶液需避光保存，临用前将明胶加热溶解后，按上述比例依次混合。

   pH3.5柠檬酸盐缓冲液的配制：

   柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）            25.50g

   柠檬酸三钠（C₆H₅Na₃·2H₂O）      3.50g

   去离子水                加至    100.00ml

   溶解后即可使用。

8．定影液

   硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）            20.0g

   去离子水             加至       100.00ml

   溶解即可。

9．兔抗牛IgG抗体。

（二）操作方法

    1．胶体金的制备  试验用水均要求三蒸馏水并过去离子柱，*终去离子水的电阻大于100万Ω。所有容器*终均用去离子水清洗。

   （1）采用鞣酸—枸橼酸钠还原法制备

   A液  1％HAuCl₄                   2.00ml

        去离子水                    158.00ml

   B液  1％枸橼酸钠                 8.00ml

        0.1％Mol/L K₂CO₃            0.20ml

        1％鞣酸                     0.20ml

        去离子水                    31.60ml

   将A液和B液分别于60℃水浴30min，并不时搅拌，迅速将B液加入至A液中，搅拌，颜色为深蓝色，继续加热至100℃，5 min～10min，溶液颜色变为深红色，自然冷却后4℃保存。

   （2）胶体金鉴定：外观呈深红色、晶莹透亮，迎着日光可见有光带。电镜观察胶体金粒子大小平均为10nm，颗粒大小一致，分布均匀。

    2．胶体金与兔抗牛IgG用量比例的确定  每ml胶体金所需的稳定蛋白量是30µg，根据试剂用量增加20％，所以每ml胶体金所需的稳定兔抗牛IgG量为36µg。

    3．金标记兔抗牛IgG的制备  取所需量的兔抗牛IgG，加入少许去离子水，用0.1Mol/L K₂CO₃溶液调pH值为9.0（用精密pH试纸测定），同时胶体金溶液的pH值也调至9.0。在磁力搅拌下，将20ml胶体金溶液加入至兔抗牛IgG中，继续搅拌10min，加入3.5ml 3％的聚乙二醇（分子量20 000）作为稳定剂，以使其*终浓度达到0.05％，再搅拌15min后，置4℃冰箱保存备用。

    4．金标兔抗牛IgG的纯化  将金标记的兔抗牛IgG以2 500r/min离心15min，以除去胶体金的聚合物，取上清以65 000g离心1h，可见离心物分为三层，上层为淡黄色，含有未结合的兔抗牛IgG，下层为近黑色，是尚未结合的胶体金颗粒,*主要的中间层为红色，是结合良好的金标记的兔抗牛IgG，倾去上层，收集中层液，用含0.1％BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原体积的1／10，过滤除菌，分装，4℃保存备用。

    5．金标记兔抗牛IgG的鉴定

   （1）颗粒大小及均匀度鉴定：取少许金标记的兔抗牛IgG，负染，电镜观察颗粒大小及均匀度，并测量粒子直径大小。

   （2）活性鉴定：将牛IgG点样于硝酸纤维膜上，直接加金标兔抗牛IgG抗体，应显示出明显的粉红色斑点。

    6．正式试验程序

   （1）点样  以打孔器将微孔滤膜制成直径3mm的膜片。将牛结核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀释为40µg/ml，用微量加样器加1µl抗原于膜片中央，37℃烘干10min。

   （2）封闭  将膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2％BSA的PBST液中，37℃作用45min，其间振荡数次。取出后以蒸馏水洗涤1次，用滤纸吸干。

   （3）加待检血清  待检血清以PBST液做1︰160倍稀释。将膜片浸入其中，37℃作用1h，其间振荡数次。取出后，以PBST液洗涤后，滤纸吸干。此步同时设标准阳性血清和阴性血清对照。

   （4）加金标抗体  以PBST液将金标液作1︰10稀释，将膜片浸入其中，37℃作用2h，中间振荡数次。

   （5）银染  将膜片从金标液中取出，于去离子水洗涤3次，每次3min。然后将膜片浸入暗室中的银染色液中，室温下作用10min，移入定影液中，室温作用5min。然后用去离子水冲洗，自然干燥后观察结果。