猪链球菌2型检验程序

　　一、 分离步骤和程序

　　1.可采集病人的血，腹水，脑脊液或者是尸检标本;病、死猪的肝脏、脾脏、腹水、心血。4℃保存。

　　2.制作肝脏、脾脏的触片，或用腹水、血液、脑脊液涂片，火焰固定后进行革兰氏染色，油镜下观是否有成对或短链状革兰氏阳性球菌。

　　3.取有成对或短链状革兰氏阳性球菌的标本接种选择增菌培养液(含15 微克/毫升多粘菌素B，30 微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基)，或直接划线接种含两种抗生素的羊血琼脂平板培养基，在蜡烛缸或CO2 培养箱中培养。

　　二、 血清学检测

　　1.用兰氏分型乳胶凝集链球菌试剂盒进行分群

　　2.用猪链球菌1-34 个型血清进行分型取一滴猪链球菌诊断血清悬滴于载玻片上，与一滴菌悬液充分混合，或用接种环(牙签也可)刮取单个菌落直接与血清混合，观察是否出现凝集反应，同时用生理盐水做对照。

　　三、 生化反应

　　可用API 生化鉴定系统的api-strep 手工鉴定条进行鉴定，该方法可直接鉴定到种。普通实验室可以重点做VP , 七叶苷水解试验，6.5%的氯化钠生长试验，45 度﹑10 度生长试验，胆汁耐受(麦康凯培养基)。结果依次为阴性，阳性，阴性，阴性，阴性，阴性，可初步认为猪链球菌。可送交到有条件的单位做进一步鉴定。 具有参考价值的生化反应项目有：

　　生长特性

　　10℃ 45℃ 6.5%NaCl PH9.6 麦康凯培养基(胆汁耐受)

　　不生长 不生长 不生长 不生长 不生长

　　发酵试验

　　棉子糖 RAF 乳糖LAC 甘露糖MNS 山梨醇SOR 阿拉伯糖ARA 核糖RBS

　　+ + — — — —

　　葡糖INU 甘露醇MAN 丙酮酸 PRV 甘油Glycerol 松三糖melezitose 马尿酸盐hippurate

　　+ — — — — —

　　四、 基因鉴定，包括使用PCR 技术和对PCR 产物进行序列分析

　　可挑取分纯的菌落或在选择平板上湿润的可疑菌落，直接进行PCR 检测。

　　1、 检测猪链球菌种特异性16S rRNA。

　　上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa

　　2、 检测猪链球菌荚膜多糖基因(cps2A)

　　上游引物：gttgagtccttatacacctgtt 下游引物：cagaaaattcatattgtccacc

　　3、 检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段(mrp)

　　上游引物： ggtatacctt gctggtaccg ttc

　　下游引物：agtctctaca gctgtagctg g

　　4、PCR反应的条件：

　　94℃预变性5 分钟;94℃、30 秒，60℃、30 秒，72℃、30 秒，25 个循环，最

　　后延伸72℃、5分钟。取5 微升扩增产物在1.2℅的琼脂糖凝胶中进行电泳。

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