玫瑰花环试验

实验原理

动物T淋巴细胞表面具有结合异种动物红细胞的受体，称为E受体，在体外一定条件下，能与绵羊等动物的红细胞结合，形成以T细胞为中心，红细胞环绕在周围，宛似一朵玫瑰花样的花环，故取名为E玫瑰花环试验(erythrocyte rosettes assay)或自然花环形成试验。凡能与RBC形成E花环的淋巴细胞称E花环形成细胞(Erosette forming cell，ERFC)。目前公认绵羊红细胞(SRBC)受体是人、骡、牛、山羊、猪等T淋巴细胞的特异标志，ERFC就是T细胞。这种玫瑰花环形成不需任何物质的刺激，故也称自然玫瑰花环形成试验。

在E玫瑰花环形成试验中，当一定比例的淋巴细胞与绵羊红细胞混合后，不放置冰箱中孵育，早期离心、镜检，可见一部分T细胞与SRBC形成玫瑰花，称之为“活性玫瑰花(active rosette)"，或称为“早期玫瑰花(early rosette)"；而放置低温4℃孵育后，形成的玫瑰花称为总玫瑰花(total rosette)或晚期玫瑰花(late rosette)。

早期玫瑰花环形成的T淋巴细胞是对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，它与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平zui为简便快速的方法之一。在总玫瑰花环试验中，静止期和活动期的T淋巴细胞，均能与不同数量的SRBC自发形成E花环，所得E花环的百分率和数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分率和总数。

实验试剂

1. 抗凝剂200u/ml肝素生理盐水溶液或38%柠檬酸钠液。

2. 豚鼠抗凝血及家兔脱纤血或阿氏液保存的血液。

3. 淋巴细胞分层液比重为1077～1078(或1082～1084)。

4. 吸收灭活小牛血清小牛血清56℃ 30min灭活后，取2体积的小牛血清，加1体积压积的家兔红细胞，混匀，置37℃水浴30min，离心沉淀，吸取上清液，4℃冰箱保存。

5. 无钙镁Hanks液，pH值7.4。

6. 固定剂0.8%戊二醛。

7. 染液配制方法：

Ⅰ液瑞氏粉0.1g，甲醇60ml，研碎混匀。

Ⅱ液姬姆萨氏粉0.5g，纯甘油33ml，甲醇33ml，先将姬姆萨氏粉溶于甘油中，并置60℃温箱中(或水浴中保温15～2h)，zui后加甲醇即可。

使用时，分别将Ⅰ液和Ⅱ液用pH值6.4 PBS稀释1倍。

实验步骤

1. 1%家兔红细胞悬液的制备  取家兔脱纤血或阿氏液保存的血液，以Hanks液洗三次，2000 r/min离心10min后，将压积红细胞用Hanks液配成1%悬液，含红细胞数约为1×10⁸/ml。

2. 豚鼠淋巴细胞的分离  取肝素抗凝血10ml，加等量Hanks液稀释后，用毛细吸管沿管壁缓缓加入装有淋巴细胞分层液的试管内，使血液重叠于分层液上，用水平离心机以2，000 r/min离心30min。此时红细胞沉降至zui下层，上层为血浆，中层为分层液，血浆与分层液的界面有一白色狭带为淋巴细胞和单个核细胞层。用毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单个核细胞，置于离心管中，用Hanks液洗涤，1 000 r/min离心10min，反复1次，zui后用Hanks液配成1×10⁷个细胞/ml浓度的细胞悬液。必要时可用台盼蓝试验进行存活率检查，应在95%以上(活细胞不着色)。

3. 玫瑰花环形成试验取上述淋巴细胞悬液0.3ml，加入1%家兔RBC 0.3ml及灭活小牛血清0.1ml，混匀，37℃水浴保温25min，取出以500 r/min离心5min，弃上清，留少许液体，即可用此细胞液涂片或滴片进行观察，此时见到的玫瑰花环即为活性玫瑰花(Ea)。

如将此细胞液置4℃冰箱中作用2h(或过)取出后，再加入0.8%戊二醛2滴，轻轻旋转试管，使沉淀的细胞重新悬浮，用毛细管轻轻混匀。此时观察到的玫瑰花环为总玫瑰花(Et)。

4. 制片、镜检及结果

   1) 湿片：取上述细胞液一滴加于事先铺有瑞氏染液的玻片上，覆以盖玻片，在高倍镜下观察，凡吸附4个或更多家兔红细胞的单核细胞，为RE花环形成细胞，共计数200个细胞，算出百分率。

   2) 干片：取培养物1滴于载玻片上，涂片、干燥，滴加甲醇固定5min，用pH值6.4 PBS冲洗，加Ⅰ液染4min，冲洗，再加Ⅱ液染4min，冲洗，待干，镜检。红细胞染成红色，淋巴细胞染成蓝色。可见淋巴细胞周围吸附有不同数量的红细胞，呈玫瑰花环状。

注意事项

1. 试验用家兔红细胞要新鲜，采血后当天使用，但阿氏液保存的血液也不宜超过两周。

2. 因为只有活淋巴细胞才能与家兔红细胞形成玫瑰花环，因此试验用血液要新鲜，随采随做。

3 .试验中加入1%小牛血清，能增加玫瑰花环形成的稳定性。用前须将血清以家兔RBC吸收，以去除对家兔红细胞的天然抗体，否则抑制玫瑰花环的形成。

4. 分离豚鼠单个核细胞所用分层液的比重大小与细胞获得率密切相关，一般以1082～1084zui为适宜。

5. 淋巴细胞与家兔红细胞比例以1∶40～1∶80较为适宜。

6. 用木瓜蛋白酶处理的家兔RBC作RE花环试验，所得RE花环率有一定程度的提高。

7. 各淋巴细胞表面的红细胞受体数量和对红细胞亲和力的程度有所不同，即使在同一实验条件下，吸附红细胞的数目也不同。试验中可见到各种形式的花环，如环形花环，即整个淋巴细胞表面均吸附有红细胞，一般在8个以上；不整形花环，即淋巴细胞表面有部分空缺，一般吸附4个细胞以上；有些淋巴细胞仅吸附1～3个红细胞。为避免可能因红细胞重叠在淋巴细胞上而造成误差，故应选择吸附3个以上红细胞为ERFC。