环状RNA研究深度剖析（一）

1.环状RNA为什么火？它到底是何方神圣？

2013年两篇Nature[1][2]文章的出世，彻底颠覆了我们对RNA的传统认知，同时也迅速引爆了整个生物医学界！经过严格统计汇总后，2017年国家自然科学金获批的项目中环状RNA研究相关的项目总数高达176项，其中有两项杰出青年基金，一项优秀青年基金，两项重点项目，94项面上项目，62项青年基金项目，15项地区科学基金项目。

从获批学科方向角度分析，发现肿瘤学方向是环状RNA研究获批项目中最多的学科方向，而消化系统相关肿瘤是其中获批最多的学科单项，除此之外，循环系统的环状RNA研究也是异军突起，一跃成为第二大环状RNA研究领域。其实医学方向除了肿瘤学和循环系统以外，其他方向也都获得资助，比如中医学和药理学方向，相信未来其他类型的肿瘤和学科方向必定会争取更多的环状RNA课题资助。与此同时，生命科学方向环状RNA研究显得略微低调些，从获批的16个项目来看，基础的遗传学和生物信息学(C06)和畜牧业(C1701)相对受到更多的重视，相信如果突破相关研究领域的技术瓶颈，在生命科学方向会出现更多的环状RNA研究项目。

从获批研究内容分析，发现与2016年相比，2017年获批的项目中，只进行环状RNA表达谱分析的课题非常少，绝大部分是针对环状RNA的功能机制展开，这表明环状RNA研究已经实现从基础筛选到特定功能机制研究的过度。值得一提的是，其中环状RNA与microRNA相互作用是目前最常见的，也是项目数占比最多的研究思路，另外外泌体来源的环状RNA项目也比较多，也是目前环状RNA的重要方向。 那么接下来，小编将从以下几个角度讲解环状RNA目前的研究思路。 环状RNA是什么？ 环状RNA（circRNAs）是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。目前发现的circRNAs主要来源于基因外显子exon，但还有其他类型，比如来源于内含子intron，基因间intergenic，反义链antisense，重叠区sense overlapping。

circRNA的主要特征有哪些呢？ (1)circRNA由于反式剪切，大量存在于真核细胞的细胞质中（定位于细胞质是miRNA海绵机制研究的充分必要条件），少部分内含子来源的circRNA存在于核酸内，具有一定的组织特异性、时序和疾病特异性（灰常适合做分子标志物哦）。circRNA广泛存在于人体细胞中，有时超过其线性异构体10倍之多。 (2)与传统线性RNA相比，circRNA分子没有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定。（RNaseR耐受实验，验证circRNA的环形结构） (3)部分circRNA含有miRNA应答元件，可充当竞争性内源RNA（ceRNA），与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵作用，进而解除miRNA对靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。（具体研究见下） (4)可以翻译成蛋白质，但大部分是非编码RNA。（与表观结合：可通过m6A甲基化翻译蛋白质[3]）

2.环状RNA的研究思路是怎样的呢？ 

所谓兵马未动，粮草先行！环状RNA的研究也是一场没有硝烟的战争，须得抢占先机，方能知己知彼，百战不殆。为了各位在这场“战争”中取得胜利，云序生物为大家准备了环状RNA研究的思路宝典，如下。 从文章的工作量、难易程度及杂志发表角度看，小编把环状RNA研究思路分为表达谱分析，生物标志物，功能机制研究三大类。那么接下来小编将从这三个角度给大家详述。 不论从哪一个角度，首先需要确定好研究物种，疾病模型，样品类型等基本信息。接下来，通过高通量手段即RNA-seq（云序提供全转录组-seq或circRNA-seq）或文献报道，筛选差异表达的circRNA。如果想短平快的发表3-5分的文章，那么表达谱分析显得再合适不过了。如果有大量的临床样本，那么做分子标志物也是很easy的，思路和表达谱分析相似如下图展示，不过多了临床样本的统计和验证。（比如KM曲线，ROC曲线，PAM分析等等）

接下来，便是重头戏，circRNA功能机制研究如何进行呢？ 这要看各位想从哪个角度入手了。目前circRNA研究的功能机制大致分为：miRNA海绵，与功能蛋白结合，顺势调控来源基因表达，还有就是circRNA上发生RNA甲基化可翻译蛋白质等。其中miRNA海绵是目前做的最普遍，也是目前申请的国自然里占比最多的。接下来小编会好好介绍一下这一方面的研究思路及研究方法。 miRNA海绵机制： 通过高通量测序手段得到一批数据后，很多人会犯愁到底怎么运用数据呢？想必下面这篇文章[4]大家都烂熟于心了吧？那么小编再次带大家领略一下高分环状RNA的风采。

高通量测序产生的数据，需要进一步实验手段进行验证。而在诸如Nature communication这类高分杂志中，验证工作可谓是面面俱到。不仅包括表达量验证，还包括结构验证，细胞定位及功能验证等。有的甚至还包括环状RNA形成机制的研究，在这儿不赘述。

体外差异环状RNA的验证 a表达量验证：qPCR b结构验证：由于circRNA不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定。可通过RNase R耐受性实验验证其环形结构。 c细胞定位：由于circRNA是在细胞质中发挥miRNA海绵机制，因此需要通过核质分离实验或FISH验证其在细胞中的定位。 d功能验证：对上述步骤筛选出的1-2条circRNA设计siRNA或者过表达质粒，通过一系列细胞表型实验，验证circRNA所发挥的细胞功能。最终挑选表型最为显著的circRNA做后续机制研究。