生物技术常用实验操作简单介绍

一、总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.  提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2.  将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；

3.  在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4.  取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5.  弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6.  让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7.  用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

二、琼脂糖核酸电泳

1.  用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；

2.  根据欲分离DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；

3.  放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；

4.  室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；

5.  向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；

6.  在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；

7.  接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；

8.  根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；

9.  电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

琼脂糖凝胶浓度  线形DNA的最佳分辨范围（bp）

0.5%   1,000～30,000

0.7%   800～12,000

1.0%   500～10,000

1.2%   400～7,000

1.5%   200～3,000

2.0%   50～2,000

三、胶回收纯化DNA

1.  琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；

2.  按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；

3.  取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；

4.  加500μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液；

5.  重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的wash buffer；

6.  将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。

7.  注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步骤不变。