生物标志物biomarker检测技术进展（三）

ELISA酶联免疫分析

ELISA（酶联免疫分析）是很早被应用于体液样本临床蛋白标志物检测的技术，因而也被当成“金标准”来使用，但事实上受制于较简单的实验范式和有限的优化措施，ELISA技术的灵敏度非常有限。而ELISA由于其使用抗体的不同，结果也会体现不同的检测效力。粗制多克隆抗体，亲和纯化的多克隆抗体，和单克隆抗体都在ELISA中有广泛的应用。在构建试剂盒时经常会需要对抗体的特异性，灵敏度等进行测试。应用不同的样本进行同一个抗体的Western Blot测试可以帮助我们判断抗体的特异性。对各种来源的抗体进行比较和优化，对于开发ELISA试剂盒，起到最为基础的作用。

Multiplex多重标志物检测技术

ELISA技术已经非常成熟且容易掌握，但其灵敏度和检测通量较低的问题吸引研究者的关注，并尝试开发更好的技术来替代这种传统方法。由于大量获取较廉价数据的需要，亦或是在样本量有限而需要获得较多数据时，多因子或多重分析物同时鉴定的技术对研究者意义重大。

代表性的多重生物标志物检测技术包括平面矩阵式检测和液相悬浮芯片。平面矩阵式检测以R&D等公司的固相蛋白芯片为代表，通过在固相芯片的不同位置免疫捕获不同的标准品或者样品，来利用空间位置实现不同样本的识别，而酶标二抗所产生的显色反应强弱报告了每个样本点的特定分析物含量，仪器通过简便的读卡就能判断不同分析物的含量。固相蛋白芯片分析重数较低以及动力学范围较窄的特性使得这项技术的应用受到一定限制，更适合于定性检测或者相对含量的判断。

液相悬浮芯片以Luminex平台为代表，BD等公司的CBA技术也可以归为此类。Luminex液相悬浮芯片采用的红色-红外双色/三色染料混合荧光编码，可以实现约100种/500种不同身份微球的识别。当把特定颜色的微球与检测特定指标的抗体偶联起来以后，不同微球就可以在同一份样本中独立工作，去分别捕获不同的标志物。该技术所使用的二抗仍然是标志物特异性的，上面带有生物素标记，可以同链霉亲和素-藻红蛋白显色剂结合。因此这项技术的研发关键也是要有针对同一抗原分子不同表位的抗体对。在检测结果时，与同一份样本孵育的不同微球会被两束独立工作的激光照射。红色激光用来识别微球的身份，从而告诉仪器正在检测的是哪种指标。另一束绿色激光激发藻红蛋白，从而依靠荧光产量判断分析物含量。CBA与Luminex有较为类似的编码方式，不同之处在于使用同一束激光来既判断微球身份，又判断分析物含量。在荧光补偿，仪器调整方面对操作者提出了更高要求。受制于物理特性，试剂盒检测分析物的重数也比较少，一般在10重左右。与此相对，得益于两束激光的协同工作，Luminex能把物理干扰减到更低的程度，理论上做到500重的同时检测都可实现。开发多重检测试剂盒的瓶颈不再是光学特性，而是不同抗体的交叉反应。尽管人们尝试各种办法尽量减低不同抗体对（antibody pair）的交叉反应，但在实际的试剂盒开发工作中，如果坚持对数据质量较高的要求，最高可接受的检测重数大约在40重左右。当液相悬浮芯片应用于核酸检测的时候，由于无需考虑抗体造成的交叉反应，检测重数可以大大增加。

液相悬浮芯片在实际的检测工作中具备明显而有力的价值。首先，液相悬浮芯片在取得接近于ELISA灵敏度的同时，有较大的检测范围（实际在3.0-4.5之间），具备较好的检测效力。其次，在低至25微升样本中可实现多达40重不同指标，能解决大量研究中都会遇到的样品量和数据量之间的矛盾。再次，较低的检测价格和较少的劳动力投入提高了该技术受使用者欢迎的程度。最后，在同一份样品中检测不同指标可以很好的进行样品内不同指标的内参对照，得到具备独特价值的数据。液相悬浮芯片的不足之处在于灵敏度相对ELISA并无根本突破，而且多指标检测时不同反应相互干扰会带来潜在的数据风险。因此，对于数据要求较高的项目，特别是药物研发等医药研究领域，液相悬浮芯片的弱点常常无法忽视。