生物样品的自动前处理

图1.  Co-Sense for BA系统基本配置图。

在血浆、血清和尿样等生物样品的分析中，在前处理中去除蛋白和其它基地物质等大分子的干扰，对于目标小分子药品的分析是非常重要的。本文介绍了一种有效的在线预处理柱，实验表明效果良好。

Co-Sense for BA系统利用独特的“Shim-packMAYI 系列”样品预处理柱，实现生物样品的自动前处理，获得更好的重现性。

高灵敏、高选择性的LC/MS技术是进行药物代谢动力学、临床和代谢产物研究的有力手段。血浆、血清和尿样这类生物样品，在LC/MS进样前通常进行前处理以尽可能地减小蛋白和其他基底物质对分析的影响。最近，开发出几种限制性通路媒介Restricted Access Media（RAM）柱，用于生物样品的在线前处理。已见报道的用于自动样品预处理柱还包括内表面反相柱，混合功能硅胶柱，半透表面硅胶柱，二醇硅胶柱等。

甲基纤维素涂覆固定的反相前处理柱MC-ODS（Shim-pack  MAYI-ODS），使用甲基纤维素修饰多孔硅胶，并将其内表面以ODS修饰。

图2.  使用不同导入液，血浆中添加药物的回收率（添加浓度为0.5μg/ml，进样体积：50μl）。

外表面涂覆的甲基纤维素可防止蛋白质的吸附，而小分子通过与ODS基团间的疏水作用被内表面保留。Shim-pack MAYI-ODS柱连同柱切换技术一起，可以实现血浆等生物样品的直接进样。而反相RAM柱对极性化合物保留较弱。由子保留机制为疏水作用，这就会降低极性化合物的回收率。MC-SCX（Shim-pack MAYI-SCX）柱和Shim-pack MAYI-SAX柱的孔中含有离子交换基团，可以成功地用于血浆中亲水性化合物的分析。

Shim-pack MAYI系列色谱柱是用于生物样品捕集和浓缩分析的HPLC在线预处理柱，填料为全多孔高纯度球形硅胶。硅胶外表面涂覆甲基纤维素聚合物，孔内化学键合固定相如C18等。MAYI系列色谱柱具有多种固定相可供选择。

蛋白质等生物分子通过体积排阻效应被MAYI柱去除，而小分子的目标化合物可以进入孔内，并基于疏水作用被柱保留。在柱切换系统中使用MAYI预处理柱，蛋白分子被自动去除，继而可对目标小分子化合物进行分析。自动样品除蛋白和目标化台物分析完美地结合起来。

图3.  血浆中5种药物的SIM色谱图：A为标样，B为血浆添加样。

系统配置

图1为Co-Sense for BA系统典型的配置。自动进样器进样，样品由C泵带入MAYI柱。MAYI柱捕集、富集目标分析物，同时蛋白质被去除。除蛋白操作结束后，通过阀切换，保留在MAYI柱的目标分析物被反冲入分析柱，继而被分离和相应的检测器检测（UV、MS、MS/MS等）。

对于Co-Sense for BA系统，为了样品分析更有效，使用C泵的溶剂切换阀并添加D泵引入稀释液。利用溶剂切换阀，可以使用C2（C3或C4）溶剂冲洗前处理流路，减少交叉污染。稀释泵可加快蛋白和分析物之间的分离，提高回收率。

图4.  5种药物的定量标准曲线。进样为10ml大鼠血浆添加样。

MAYI-ODS柱的方法建立

除蛋白

MAYI柱除蛋白所需时间与柱尺寸、流速、稀释倍数和溶剂种类等因素相关。蛋白从MAYI柱清除完成前，不进行阀切换。这样可以避免分析柱、系统管路的堵塞。蛋白从MAYI柱的洗脱情况通过紫外260nm监测。血浆样品进样后，蛋白吸收降为1mAbs所需时间见表1。其中，稀释倍数为8（C泵流速/D泵流速=1/7），溶剂为10nM乙酸铵/乙腈=95/5，MAYI-ODS（4.6mml.DX10mml）。

导入溶剂（预处理流动相）

样品导入溶剂（图1中C1流动相）将样品送入捕集柱。生物样品中，药物一类的低分子量物质通常与蛋白分子结合。有时药物分子可能在使用MAYI-ODS除蛋白的操作步骤中一起被去除，造成回收率低。

表1.  使用MAYI-ODS前处理主血浆中除蛋白所需时间

因此为获得高回收率，可以通过优化导入溶剂，削弱蛋白与药物分子间的结合。调节样品导入溶剂中的离子强度和其中有机相的比例，是提高回收率的有效手段（图2）。

通常，在样品导入溶剂中添加10％或更低浓度的乙腈有利于提高回收率。由于血浆样品中白蛋白的Pl，值接近4~5，所以载入溶剂的理想的pH值范围应为2~3或6~7，以防止白蛋白在系统中沉淀，造成堵塞。使用同样的溶剂作为分析流动相A也是节省人力的便捷方式。

此外，Co-SenseforBA系统包括一台D泵，用于样品的在线稀释。样品可被导入溶剂自动稀释，以利于目标药物分子从蛋白中分离。当导入溶剂不能提供足够的回收率时，在线稀释也是改善回收率的有效方法。稀释用的溶剂和样品导入溶剂（C1）相同

表2.  添加在血浆中的5种药物分析条件

应用MAYI—ODS

MAYI柱作为在线预处理柱，使用优化的填料和涂覆技术，不仅能够有效去除蛋白，而且显示出长期的稳定性和宽广的生物样品使用范围；Co-Sense for BA与LC/MS联用，在6min的分析周期内完成了5种添加在血浆中的药物分析（图3）。

这几个药物在MS检测中，以ESI正离子选择离子模式（SIM）检测每种药的［M+H］离子。分析条件列于表2。

血浆样品显示出和标样类似的洗脱曲线，这一分析方法表现出优异的结果和重现性。回收率和线性见表3和图4。

表3.  检测化合物重现性和回收率（1μg/ml，5μl）

结论

通过使用独特的涂覆及优化的填料技术，Shim-pack MAYI系列显示了除蛋白的前处理功能。包含MAYI前处理柱的Co-Sense for BA系统实现了血浆类生物样品的自动前处理，由此免除了人工的前处理操作。MAYI柱适用范围广，耐久性好，具有不同种类的固定相。由于消除了手工样品前处理的误差和非持续性，该系统为定量分析提供了更高的可靠性。Co-Sense for BA系统是生物样品的自动前处理的有力工具。