生物样品分析方法确证（二）

上周一概括了下生物样品分析方法确证的选择性、准确度、精密度、残留、线性范围、最低定量限和稀释可靠性，剩下的回收率、基质效应和稳定性是涉及的内容比较多，或者考察方式是大家对指导原则的理解容易出现分歧的。

1.    回收率和基质效应

回收率是考察方法对待测物和内标的提取回收效率，采用液液萃取和固相萃取方法对回收率的影响比较大，回收率不要求达到100%，但需要保持稳定，不影响分析结果。

基质效应是考察基质组分存在对待测组分测定的影响，使用至少6批来自不同供体的空白基质，空白样品处理后加入分析物和内标，对比不含基质的相同浓度的分析物和内标的峰面积，来得到基质因子，需要测定基质效应对低浓度和高浓度的待测组分的影响。

回收率和基质效应可以一起考察，需要使用至少6批空白基质（不同供体，不能混合）处理三批样品，分别为：

A．        将待测物和内标加入到空白基质中，与样品或质控样品处理方法相同处理

B．         处理空白基质，处理空白基质后加入待测物和内标

C．         含待测物和内标的纯溶液，使其和A与B中待测物和内标浓度的理论值相同，且尽量使其溶剂也相同

回收率为：

其中Astd为待测物峰面积，AIS为内标峰面积，括号中A和B表示为上述A、B中的样品，下同。

基质效应：
指导原则中没有要求同一批基质需要做的平行样品的数量，但要求6批基质经过内标归一化计算的基质因子的变异系数不得大于15%。除正常基质外，还应关注特殊基质，如溶血、高脂的血浆样品。

2.    稳定性：

稳定性考察是分析方法确证非常重要的一部分，只有确保分析方法的每一步待测物都是稳定的，才能保证分析结果的准确和可靠，稳定性考察包括分析物和内标溶液的储存稳定性、待测物和内标在基质中稳定性（短期、长期、冻融）和样品处理后的稳定性。

a．         溶液的稳定性：考察待测物和内标的储备液的稳定性，和工作液的稳定性，需要保证每次取用的溶液浓度都是准确可靠的。

b．         质控样品的短期放置稳定性：考察时间可根据实际情况定，需要保证样品从采样到冷冻保存这个时间范围以及样品融化到处理的这个范围内，待测物和内标在基质内是稳定的，考察方法是将质控样品在室温放置一段时间，然后与刚配制的质控品同步处理，比较待测物和内标的变化。

c．          质控样品的长期稳定性：考察生物基质中待测物和内标在冰箱中长期储存的稳定性，考察时间应能够覆盖整个检测周期

d．         质控样品的冻融稳定性：生物样品一般冷冻保存，处理前需要解冻，取完样品后需要再放回冰箱保存，所以需要考察样品冻融过程中分析物和内标的稳定性，FDA指导原则要求需要考察至少3个冻融周期的稳定性。

e．         处理后样品的稳定性：至少需要考察处理后样品在自动进样器温度下的稳定性，考察时间必须要大于样品处理完到检测完成的时间，如果必要的话，还需要考察处理后的样品放置于冰箱中的稳定性。

3.其它：

为了保证检测结果的准确和可靠性，也有实验室提出需要考察一个分析批能耐受的样品数量，根据样品分析过程中，一个分析批终检测样品的数量，在确证时考察不小于这个数量的质控样品的准确度。