用于表达分析的mRNA的制备实验——备择方案

用基于磁珠方法纯化 cDNA 和体外转录产物避免了纯化过程有机溶剂的使用和离心步骤。这个方案与基本方案中的纯化方法相当（步骤 10～14 或者步骤 17～22）。

待纯化样品：cDNA或体外转录的 RNA

羧基端包埋的磁珠EDTA乙醇Tris acetate

磁力架（CPG）

1. 实验前准备

1.1 材料

待纯化样品：cDNA（见基本方案步骤 11）或体外转录的 RNA（见基本方案步骤 19）

1.2 试剂

羧基端包埋的磁珠（cDNA 纯化：PerSeptive BioSystem； 体外转录纯化：Bangs Laboratories）

0.5 mol/L EDTA

3.5 mol/L NaCl/20％（m/V）PEG 8000（分子生物学级；无 RNA 酶）

70％（V/V）乙醇于无 RNA 酶的水

10 mmol/L Tris acetate， pH 7.8（无 RNA 酶）

1.3 耗材

磁力架（CPG）

2. 纯化 cDNA：

2. 1 每 150 ul cDNA 反应液取 10 ul 磁珠（Perseptive），将所需磁珠放.入同一个微量离心管。

2.2 把这个离心管放到磁力架上，让磁珠沉到一侧管壁。用枪小心地吸走上清。

2.3 加入与起始磁珠体积相等的 0.5 mol/L EDTA，轻轻摇振重悬磁珠。再次把管子放到磁力架上，待磁珠分离后，吸去上清。再重复此洗涤步骤两次。

2.4 用与起始磁珠体积相等的 0.5 mol/L EDTA 重悬磁珠。

2.5 每管 cDNA 加.入 150 ul 3.5 mol/L NaCl/20％ PEG 8000 和 10 ul 磁珠，轻轻摇振或涡旋混匀。室温下放置 10 min。

2.6 把离心管放到磁力架上，让磁珠沉到一侧管壁（第一次约 2 min， 洗涤时可以快点）。

2.7 弃去上清，用 150 ul 70％ 乙醇洗涤两次。最后一步尽量吸干乙醇，晾干 2 min。

2.8 加入 25 ul 10 mmol/L Tris-acetate（pH 7.8），室温放置 5 min 洗脱 DNA。

2.9 把离心管放到磁力架上，吸取并保存上清。

2.10 通过 PicoGreen 的荧光测定 cDNA 的浓度。

3. 纯化体外转录的 RNA：

3.1 每 60 ul 体外转录反应液取 20 ul 磁珠（Bangs Laboratories），将所需体积磁珠放进同一个微量离心管。

3.2 把这个离心管放到磁力架上，让磁珠沉到管壁一侧。用枪小心地吸走上清。

3.3 加入与起始磁珠体积相等的 0.5 mol/L EDTA，轻轻摇振重悬磁珠。再次把管子放到磁力架上，待磁珠分离后，吸去上清。再重复此洗涤步骤两次。

3.4 用与起始磁珠体积相等的 2.25 mol/L NaCl/10％ PEG 重悬磁珠。

3.5 每管体外转录反应液加入 60 ul 3.5 mol/L NaCl/20％ PEG 8000 和 20 ul 磁珠，轻轻摇振或涡旋混匀。室温下放置 10 min。

3.6 把离心管放到磁力架上，让磁珠沉到管壁一侧（第一次约 2mim 洗涤时可以快点）。

3.7 弃去上清，用 150 ul 70％ 乙醇洗涤两次。最后一步尽量吸干乙醇，晾干 3 min。

3.8 加入 25 ul 10 mmol/L Tris-acetate（pH 7.8），室温放置 5 min 洗脱 RNA。

3.9 把离心管放到磁力架上，吸取并保存上清。

3.10 测定 260 nm 的吸收值，定量 RNA 浓度。