用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法（一）

一种用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法
来源：方统科技
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摘要： 本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法。该方法只需将少量(4～6mg)植物叶片、适量(200μl) TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管，在组织细胞研磨器中振动5min破碎组织后，直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点，特别适合于大量样品的基因型检测。 

王兰^{1, 2}   龙云铭²  刘耀光²
1 华南农业大学农学院，广东省植物分子育种重点实验室
2 华南农业大学生命科学学院，广东省教育厅植物功能基因组与生物技术重点实验室

摘要：本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法。该方法只需将少量(4～6mg)植物叶片、适量(200μl) TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管，在组织细胞研磨器中振动5min破碎组织后，直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点，特别适合于大量样品的基因型检测。

关键词: 水稻，DNA制备，PCR

随着生物技术的迅速发展，PCR技术已广泛应用于遗传育种的各个领域，如种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。在大规模的基于PCR的基因型检测作业中，高效快速的模板DNA制备显得非常重要。自Marmur 1961年建立用十二烷基磺酸钠(SDS)和氯仿从生物细胞中分离提取DNA样品的经典方法以来,人们一直致力于对DNA抽提方法的探讨，并先后报道了一些关于DNA抽提的方法（Dellaporta et al., 1983; 宣朴等，1998；汪秀峰等，2002；周淑芬等，2004）。但这些方法仍然烦琐费时。本研究对作为PCR模板的植物基因组DNA制备方法作了简化,只需将少量叶片、适量TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管，在组织细胞研磨器中振荡约5min破碎组织后，直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点，特别适合于大规模的基因型检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料
试验材料为粳稻品种台中65（T65）及其杂种不育基因Sc的近等基因系E5，以及它们杂交组合构建的F2群体，以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Columbia。

1.2 基因组DNA制备方法
剪取（或用手摘取）水稻苗或成株叶片（剪成约3～5mm小段）或拟南芥叶片约4～6mg，12～15mg，或25～30mg，放入2ml离心管中（注：2ml离心管的底部较宽，利于钨合金珠的振荡），加入200μl TE （10mmol/L Tris, pH8.0; 0.5mmol/L EDTA, pH8.0. 注：本TE中的EDTA浓度是常规TE的1/2）或200μl去离子水，放入一粒3mm直径的钨合金珠（Qiagen, Cat.69997），在多功能组织细胞研磨器（方统生物科技有限公司，型号MTM-60）上振动约5min，把叶片打碎。取17μl溶液以琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA质量，取1μl溶液用于PCR扩增。

1.3 PCR引物反应
根据公共数据库的水稻和拟南芥基因组序列设计PCR引物（表1），由英俊公司合成。Taq酶从杰顺公司购买。

表1  PCR引物序列

注：PA为拟南芥引物，其余为水稻引物，其中L14-121～P24-93为插入/缺失（InDel）标记引物。

每个PCR反应液（20μl）组成为：1× Buffer，0.2mmole/L dNTPs, 1U Taq酶,250nmole/L每种引物，1μl上述DNA溶液。PCR反应在My Cycler (BioRad)热循环仪上进行。用引物反应程序为94℃预变性3min，扩增35个循环，每个循环94℃ 20s， 55~58℃ 30s，72℃ 60s (InDel标记的PCR用30s)；最后72℃ 2min。

1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及检测　

1.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
配制6%的聚丙烯酰胺凝胶100ml工作液:分别加5.7 g丙烯酰胺 (Acri)，0.3g N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis-Acri），12g尿素，10ml 10×TBE，最后加水至100ml。灌胶前，每10ml胶液加入80μl 10%过硫酸铵，4μl四甲基乙二胺(TEMED),摇匀后迅速灌胶，胶凝固后即可点样电泳，并通过银染检测实验结果。

1.4.2 银染　
先用0.1% AgNO3染色液染色10～15min，再用显影液（100mL中含NaOH 0.5g、四硼酸钠0.019g, 0.4mL甲醛）显色,等条带清晰后，直接用自来水冲洗终止显色反应，用凝胶成像仪（BioRad）或数码相机拍照并记录实验结果。