用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸

40% (m V) 19:1丙烯酰胺 双丙烯酰胺16%聚丙烯酰胺凝胶10×TBE缓冲液尿素10% (m V)过硫酸铵TEMED甲酰胺加样缓冲液仲丁醇（2-丁醇）二乙醚1 mol L MgCl2

Saran保鲜膜或其他可透紫外光的塑料膜增感屏（如 Lightning PlusDuPont NEN)手提式短波长紫外光源硅化的玻璃棉干冰 乙醇浴（-78℃)

1) 制备一块20cm×40 cm×1.5 mm的变性胶，带有4个样品孔，孔宽为3 cm。对于分离约10〜45个碱基长的寡核苷酸，用16%的聚丙烯酰胺/尿素胶（对于更长的寡核苷酸用8%或6%的聚丙烯酰胺/尿素胶）。让胶聚合30 min以上，然后30 W预电泳 >1 h。

2) 将各寡核苷酸溶于甲酰胺加样缓冲液中至终体积200μL , 65℃加热15 min以去除 DNA 二级结构。各孔中分别加50μL样品，在30 W电泳约4 h，直至溴酚蓝移至胶的75%处。

在16%的胶上，溴酚蓝与约10 bp的寡核苷酸的移动速度一致，二甲苯青与约30 bp的寡核苷酸的移动速度一致，如果寡核苷酸为25〜35 bp长，建议甲酰胺加样缓冲液中不要加二甲苯青。

3) 移去其中一块凝胶玻璃板，用保鲜膜覆盖凝胶。将凝胶剥离并移去另一块凝胶玻璃板，使凝胶平放在保鲜膜上，用保鲜膜覆盖凝胶的另一面。

4) 在暗室内，将凝胶置于一增感屏上，用一手提式短波长紫外光源直接照于胶上以观察DNA。辨明主要的核苷酸带，用标记笔直接在保鲜膜上标记其位置，要确保光源直接照在该带上。

5) 用剃刀片小心切下该条带，尽量不要弄皱凝胶或将凝胶条弄碎。

6) 将凝胶块置于一15 mL聚丙烯管内，浸泡于5 mL TE缓冲液中，37℃振荡过夜。

7) 在一支巴斯德吸管中塞上一些硅化过的玻璃棉，并用约5 mL水预淋洗，将含有DNA的上清流过玻璃棉。

8) 反复用仲丁醇抽提将DNA浓缩至<180μL。

9) 用二乙醚抽提DNA 1次，并将其置于真空蒸发器（如Speedvac)中直至所有的二乙醚都被除掉。

10) 用TE缓冲液将液体体积调至180μL,加20μL 3 mol/L乙酸钠及2μL 1 mol/L MgCl₂,在涡旋混合器上振荡混合。

11) 加600μL的100%乙醇，来回颠倒混合，在干冰/乙醇中冷冻10 min,置于室温 5 min。室温下以最大速度离心15 min,沉淀DNA，弃去上清。

12) 加180μL TE缓冲液，在涡旋混合器中振荡使DNA溶解，加20μL 3 mol/L乙酸钠 及2μL 1 mol/L MgCl₂,在涡旋混合器中振荡混合。

13) 加600μL 100%乙醇，来回颠倒混合，在干冰/乙醇中冰冻10 min,置于室温 5 min。室温下以最大速度离心15 min，沉淀DNA，弃去上清。

14) 加800μL 75%的乙醇，在涡旋混合器中振荡混合，室温下以最大速度离心5 min，弃去上清。

15) 在真空蒸发器中小心抽干DNA沉淀（有时静电将使沉淀蹦出管子）。

16) 将DNA溶解于200μL TE缓冲液中，测定A₂₆₀和_A280。可无限期地保存于-20℃。对于序列特异性的DNA亲和树脂，假定1A₂₆₀=40μg/mL DNA。