用比浊法测定大肠杆菌的生长曲线

实验概要

了解细菌生长曲线的持点及测定原理，学会用比浊法测定细菌的生长曲线。

实验原理

将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一般分为延缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个时期，各时期的长短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。

比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度(即OD值)，用于表示该菌在本实验条件下的相对生长量。

实验设正常生长、加酸抑制和加富培养等三种处理，以了解细菌在不同生长条件下的生长情况。

主要试剂

牛肉膏蛋白胨液体培养基14支(每支10mL)，浓缩5 倍的牛肉膏蛋白胨培养基1支。无菌酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。

主要设备

1mL无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、标签等。

实验材料

大肠杆菌(E.coli)。

实验步骤

方法1：

1. 接种：取13支装有牛肉膏蛋白胨培养液的试管，贴上标签(注明菌名、培养处理、培养时间、组号)。按无菌操作法用吸管向每管准确加入0.2mL的大肠杆菌培养液，接种后，轻轻摇荡，使菌体混匀。另一支不接种的培养管注明CK(对照)。

2. 培养：将接种后的培养管置于摇床上，在37℃下振荡培养。其中9支培养管分别于培养的0、1．5、3、4、6、8、10、12和14h后取山，放冰箱中贮存，待测定。加酸处理。取出经4h培养的另二支培养管，按无菌操作法加入lmL无菌酸溶液，摇匀后放回摇床上，继续振荡培养，于培养8h和14h后取出放冰箱中贮存，待测定。加富营养物处理。余下的二支培养管于培养6h后取出，按无菌操作法加入浓缩5倍的牛肉膏蛋白胨培养液1mL，摇匀后，继续进行振荡培养，于培养8h和14h后取出，放入冰箱中贮存，待测定。

3. 比浊：将培养不同时间、形成不同细胞浓度的细菌培养液进行适当稀释，使光密度值在0.0-0.4范围内，以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基调零点，在光电比色计上，选用400-440nm波长的滤光片进行比浊，从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。

方法2：

将大肠杆菌接入装有牛肉膏蛋白胨培养液的小试管中(试管要能插入放比色杯的比色槽内)。37℃下振荡培养，分别在0、1.5 、3、4、6、8、10、12和14h取出，以未接种培养液调零点，在光电比色计上比色。比色时应自制一个暗盒将培养管和比色槽罩住，以形成一个暗室。

绘制曲线：

以细菌悬液的光密度值(OD)为纵坐标，培养时间为横坐标，给出大肠杆菌在正常生长、加酸处理和加富培养三种条件下的生长曲线。

如果我们将上述培养0，1.5，3，4，6，8，10，12，14h的细菌悬液用稀释平板测数法进行测数，测出不同时间的含菌数，以菌悬液比浊的光密度值为横坐标，以细菌的数量为纵坐标，绘制一标准曲线，这样在测得了任一培养时间的菌悬液光密度值后，就可以在此标淮曲线上查出含菌数。这种方法已在工业上广泛采用，它可以节省许多稀释平板测数的时间，直接用比浊法测得的光密度值查标准曲线以了解各个培养时期的菌数消长情况。