用离子交换层析法从DNA中去除溴化乙锭实验

DNA 样品

乙醇 HCl NaCl 酚 氯仿 TE TEN 缓冲液

Dowex AG50W-X8

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙醇，HCl (1 mol/L) ，NaCl ( 5 mol/L)，酚，酚：氯仿（1:1，V/V) ，TE ( pH 8.0)，TEN 缓冲液，含 0.2% 叠氮钠的 TEN 缓冲液。

2. 核酸和寡核苷酸

经过氯化铯梯度离心纯化的 DNA 样品。

3. 离心机和转子

Sorvall SS-34 转子或相当产品

4. 专用设备

Dowex AG50W-X8 ( 100~200 目，干燥尺寸）（Dowex AG50W-X8 为一种阳离子交换树脂，可从 BioRad 公司获得。），玻璃棉，折光仪（可选）（尽管并非必需，但在估计氯化铯溶液密度时折光仪十分有用。）。

二、方法

1. 使用前，平衡 Dowex AG50 树脂：

(1) 将约 20 g Dowex AG50 树脂溶于约 100 ml 的 1 moI/L NaCI 中，搅拌 5 min。待树脂下沉后，吸出上清弃去。

(2) 加入约 100 ml 的 1 mol/L HCl 继续搅拌悬浮液 5 min。树脂下沉后，吸出上清弃去。

(3) 用水继续重复此步骤两次（每次 100 ml )，再用 100 ml TEN 缓冲液洗一次。

(4) 于 4℃ 将树脂贮存于含 0.2% 叠氮钠的 TEN 缓冲液中。

2. 如图所示，在巴斯德吸管中装成一个 1 ml 的 Dowex AG50 小柱。



3. 去掉树脂上的缓冲液，用 2 倍体积的 TE ( pH 8.0 ) 洗柱，再将含溴化乙锭和氯化铯的 DNA 直接加到树脂上。

4. 立即开始收集层析柱的流出液。当所有的 DNA 溶液进入柱子后，用 1.2 倍柱床体积的 TE ( pH 8.0 ) 洗脱树脂，继续收集流出液于 30 ml Corex 管中。

5. 层析柱流干以后，用 2.5 倍体积的水稀释流出液。

6. 加入 8 倍体积的乙醇，于 4℃ 置 15 min 使 DNA 沉淀。然后于 4℃ 以 17000 g ( 12000 r/min，Sorvall SS-34 转子）离心 15 min 收集 DNA。

7. 将上清倒入一个洁净的离心管，加入等体积的无水乙醇。4℃ 静置至少 15 min，然后以 20000 g ( 13000 r/min，Sorvall SS-34 转子）离心 15 min 收集 DNA。

如果第一次沉淀不能因收所有的质粒 DNA，则再加一次乙醇（Hildeman and Muller 1997）。

8. 用 70% 的乙醇洗涤上述两次所得的 DNA 沉淀，然后尽可能去除所加的 70% 的乙醇， 并让残留液体于室温下挥发。

9. 用 2 ml H₂O 或 TE ( pH 8.0 ) 溶解 DNA 沉淀。

若用于 DNA 测序，DNA 应溶于 H₂O 中；若 DNA 需长期保存，TE ( pH 8.0 ) 是更好的选择。

10. 若此重溶后的 DNA 从其颜色或当在紫外线照射时发出的荧光判断还明显含有溴化乙锭，则再次用酚或酚：氯仿抽提一次，然后再用乙醇沉淀 DNA。

11. 测定 DNA 终溶液的 OD₂₆₀ 值，计算 DNA 的浓度。分装成小份贮存于 -20℃。