用缠绕法从哺乳动物细胞中分离DNA

λ 噬菌体的线性单体和多联体 哺乳类细胞、新鲜组织或血样

细胞裂解液 乙醇 TE

脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶 Kimwipe 吸水纸 聚丙烯管 振荡平台 Shepherd 氏钩 宽口移液管

一、材料

1. 缓冲液和溶液

细胞裂解液（6 mol/L 盐酸胍，0.1 mol/L 醋酸钠（pH 5.5)）

乙醇（室温）

TE ( pH 8.0)

2. 凝胶

脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶

3. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌体的线性单体和多联体

4. 专用设备

Kimwipe 吸水纸

聚丙烯管（50 ml)

振荡平台

Shepherd 氏钩（替代透析的一种选择）

宽口移液管（开口处直径 0.3 cm)

5. 细胞和组织

单层或者悬浮培养的哺乳类细胞、新鲜组织或血样

二、方法

1. 制备细胞悬液（或冰冻细胞粉末）的裂解液。

2. 采用下面两种方法之一制备细胞裂解液。

(1) 从悬浮培养液裂解细胞

① 将细胞悬液转移至一次性聚丙烯离心管。

② 加 7.5 倍体积细胞裂解液。

(2) 从组织裂解细胞

① 将冰冻细胞粉末一点一点加入盛有约 7.5 倍体积细胞裂解液的烧杯，使其分散于裂解液表面，而后振摇烧杯使粉末浸没。

② 待所有材料溶解，将溶液转移至离心管。

3. 关上离心管盖，室温中在振摇平台上温育 1 h。

4. 在一系列一次性 50 ml 聚丙烯离心管中加入 18 ml 处于室温的乙醇。使用宽口移液管小心地使细胞悬液处于乙醇之下。

5. 用 Shepherd 氏钩缓慢搅拌细胞裂解液和乙醇间的界面以回收 DNA。DNA 将黏附在钩上形成胶状物。继续搅拌直至乙醇和水相完全混合。

6. 将黏附有 DNA 的 Shepherd 氏钩转移至另一含有 5 ml 室温乙醇的聚丙烯管中。将 DNA 浸入乙醇直至完成所有样品。

7. 移出黏附有 DNA 的每个 Shepherd 氏钩，尽量使乙醇滴干。至此，DNA 收缩成紧密的脱水团块。通常将钩的 U 型末端与 Kimwipe 吸水纸接触，便可通过毛细管作用去除大部分游离乙醇。当 DNA 上的乙醇尚未蒸发完全时，将钩转移至另一新的聚丙烯管，里面盛有 5 ml 处于室温的乙醇。

8. 当全部样品处理完毕，尽可能去除乙醇。

9. 将每个吸管转移至盛有 1 mI TE 缓冲液（pH8.0) 的新聚丙烯管中。于 4℃ 过夜，使 DNA 重新水合。

10. 在水合过程中，DNA 将呈高度凝胶状，但仍黏附于吸管上。用另一新 Shepherd 氏钩做刮刀，温和地将 DNA 沉淀从吸管上刮下来。弃去吸管，让 DNA 沉淀漂浮于 TE 中。盖上管盖，于 4℃ 在振摇平台上温育直至 DNA 沉淀完全溶解（约 24~48 h)。

11. 在脉冲凝胶电泳或者 6% 琼脂糖凝胶上分析。