用PCR控制基因组DNA文库的质量实验

ddH20Vent 缓冲液Vent DNA 聚合酶dNTP质粒 DNAPCR 引物

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备热循环仪

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

ddH₂0

2. 酶和酶缓冲液

10X Vent 缓冲液

Vent DNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP，各 20 mmol/L

PCR 引物，可以与基因组 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火

质粒 DNA(见下面第 1 步）

4. 特殊设备

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭 (见第 5 步）

热循环仪

二、方法

1. 在细菌中扩增后，用基因组文库制备的质粒 DNA 建立下列反应。

10~50ng 的质粒 DNA

50pmol 的各引物

5ul 的 10XVent 缓冲液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

1U 的 Vent DNA 聚合酶

用 ddH₂0 定容至 50ul

对下面的每种质粒载体应该分别进行反应：

表达载体，没有文库 DNA 插入

基因组 DNA 文库的混合物

少量 DNA, 由基因组 DNA 文库的单个细菌克隆制备

2. 在一个热循环仪中，94°C 将混合物预热 20s。

3. 按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。

94°C15s

55°C10s(或用引物的合适退火温度）

72°C40s

将最后一次循环的延伸时间延长至 60s。

4. 冷却至 4C。

5. 取 25ul 的各反应产物，跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sambrook and Russell 2001)

三、分析

在图 26-6 所示的例子中，对文库混合物进行 PCR 分析，其中用的引物是 PmlⅠ位点的侧翼序列，结果显示，文库中含有目的大小的插入片段，但有大量的原始载体的污染 [图 26-6(a), 第 2 泳道]。从文库中选择单个克隆进行 PCR 分析，验证了用文库混合物做模板的结果，显示文库中的原始载体大约占 40%[所分析的 24 个克隆中有 10 个，图 26-6(a), 第 3~26 泳道]。为了提高文库的质量，用 PmlⅠ酶消化文库，然后在细菌中重新进行扩增，以减少原始载体的污染。对文库混合物进行 PCR 分析显示，用 PmlⅠ消化后，无插入的环状载体的污染大大减少了 [图 26-6(b), 第 2 泳道和第 3 泳道]。用 PmlⅠ消化又重新在细菌中扩增后，在文库中随机选择单个克隆进行 PCR 分析，证实无插入 DNA 的出现频率比原始文库大大降低 [20 个克隆中有 0 个，小于 5%，图 26-6(b), 第 4~23 泳道]，并且克隆中含有预计大小的插入片段。对基因组片段文库中的克隆进行 DNA 序列分析显示，文库中含有预计大小的人类基因组 DNA 片段（数据没有列出）。因此，PCR 提供了一个快速、敏感和方便的方法，来分析原始的和改善过的文库。