用QExactive筛查未知非法添加剂三聚氰胺事件不再重演

　　【导语】三聚氰胺、塑化剂等食品安全事件，给我们带来启示：人为添加的有机非法添加剂，比农/兽药残留的危害要大得多。为什么？因为这些是不法分子为躲避现有标准检测方法设计出的添加物，比如不许食用的廉价工业原料，但这类非法添加剂对食品企业和检测机构来说是未知物。

　　这里不探讨法律/社会/道德层面的问题，单纯从技术的可操作性上来说，目前我们缺少检测未知有机污染物的有效手段，这个有效性是指：要有方法可以从几千万的有机物中筛选出，样品里到底加了什么？并且这个检测方法必须要足够简单。

　　西安质谱年会期间，分析测试百科网记者采访了赛默飞世尔科技色谱质谱部高级应用专家James Chang博士和中国市场部经理王勇为博士，他们介绍了一个有可能解决上述问题的、非常惊人的技术——Q Exactive台式FT轨道阱质谱仪，这里记录下来，希望给各位读者带来启示……

　　

　　赛默飞世尔科技色谱质谱部高级应用专家James Chang博士（左）和中国市场部经理王勇为博士（右）

　　惊人实例：食品中完全未知的化合物检测

　　James博士首先表示：“当前食品安全领域面临的一个最大挑战是：污染成分和非法添加物不断出现；人们在担忧，下一个三聚氰胺和塑化剂何时出现？”赛默飞世尔科技在今年6月的ASMS上推出Q-Exactive质谱仪，提出了一种Quanfirmation的流程，可以同时进行化合物的鉴定、定量和确证。“在食品安全检测中，Q-Exactive被证明的突出能力是简单、快速、可靠。”

　　

　　James博士随后给了两个例子，很让人吃惊。

　　美国某食品检验部门，送来一些橘子皮让James检测里面可能的危害成分，James在第一时间给出了答案——检测到橘子皮中的Imazalil（烯菌灵），Carbendazim（多菌灵），和Thiabendazole（噻菌灵），该部门非常满意。

　　美国一家知名的食品厂商，总是担心采购的原料的安全。有一次，他们给James送了5份面筋样品，希望看看是否合格。使用Q-Exactive，James很快检测到其中两份中含有三聚氰胺，这个结果让客户非常满意（这两份是客户自己掺进去的三聚氰胺），对采购的原料更有信心，也很快在他们的实验室配置了Q-Exactive。

　　分析3S：Selectivity选择性、Sensitivity灵敏度、Speed速度

　　在复杂基质中的样品分析（如食品安全、蛋白质组、代谢物分析）中，样品往往比干扰的各种基质浓度低得多，这时分析工作需解决的主要问题是去除干扰，即提高分析方法的选择性。因此，在通常所说分析的3个“S”中，先要考察Q-Exactive的选择性。

　　Selectivity选择性：

　　分辨率>50,000 时，HRMS的选择性大于MS/MS，可直接用HRMS来定性和定量

　　Q-Exactive是一个四极杆Q+一个Orbitrap，看起来跟Q-TOF类仪器比较相像：都是一个四极杆加上一个高分辨率的质量分析器。当问道James怎么来比较Q-Exactive和Q-TOF时，他表示，

　　“从分辨率的角度来看，Q-Exactive更具优势，前者只能达到40,000~60,000 FWHM，而后者可达140,000 FWHM。

　　从质量测定的准确度上看，Q-Exactive是傅立叶变换质谱Orbitrap，利用频率来检测m/z，不依赖于离子的初始化能量，它能够确保色谱峰上每次扫描质量都非常精确；而Q-TOF利用飞行时间来检测m/z，在色谱峰的前、中、后测定的质量不完全一致，总会存在能量色散，所以Q-TOF采用多个扫描做平均的方式（即RMS）来得到精确质量数。”

　　

　　4种100ppb的农药，在4种不同的分辨率下的分离情况对比

　　James接着说，“有人会问：为什么需要这么高的分辨率？我为此做了大量的实验，总结来看：分辨率应>50,000 FWHM，跨过一个色谱峰的每次扫描都能获得精确质量（不是RMS平均的），才能有效地区分复杂基质中待分析的化合物，见图例，分离100ppb下4种农药，只有分辨率达到50,000以上时才可分开这4种农药。”　

化合物	化学式	真实质量
Isozophos	C9H17ClN3O3PS	314.04895
Isoxathion	C13H16NO4PS	314.06104
Triazophos	C12H16N3O3PS	314.07225
Hexaconazole	C14H17Cl2N3O	314.08214

 

　　佐证：

　　事实上，A.Kourfman等已发表论文（Anal Chim Acta. 2010 Jul 12；673(1):60-72. Epub 2010 Jun 3., Comprehensive comparison of liquid chromatography selectivity as provided by two types of liquid chromatography detectors (high resolution mass spectrometry and tandem mass spectrometry): "where is the crossover point?".），论证比较了质谱的HR/AM（高分辨/精确质量数）和MS/MS的选择性。文中指出，当分辨率大于50,000后，HR/AM的选择性大于MS/MS（三重四极杆常用的方法）。即：当分辨率达到50,000以上时，用一级质谱HRMS，已经具有比MS/MS更高的选择性，可以直接用HRMS来定性和定量。（所以，根本就不再需要优化MS/MS的碰撞能了！）

　　HCD实现的MS/MS：增加的确认（Confirmation）能力

　　在Q-Exactive上，可用HCD实现MS/MS。据James介绍，在食品安全的应用上，Exactive的HR/AM选择性已经足够高了，但EU确证农/兽药残留的方法要求4分，仅有HR/AM得2分，所以Q-Exactive增加了MS/MS功能，获得全扫描MS/MS谱，就可以确证化合物了。

　　参考：欧盟关于质谱分析方法鉴定点数的出处

　　Q-Exactive上的MS/MS是通过HCD高能碰撞解离的功能实现的。记者看到HCD碰撞池在C-Trap之后，按通常的理解HCD应在四极杆之后、C-Trap之前，感到有些奇怪，James说“若选择做MS/MS，离子在HCD经碰撞分裂后又被送回C-Trap中，表面看来非常新奇，其实只需用电压控制就能快速实现离子的流动，所以空间上HCD池放在C-Trap之前或之后都是一样的。”

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　　Sensitivity：提高灵敏度，高分辨下可以保持高灵敏度

　　灵敏度也是食品安全及其它应用关心的问题，针对记者提出的“Orbitrap为什么在高分辨时还具有高灵敏度？”的问题，James博士回答说，“Orbitrap的体积很小，仅有2寸大小；真空度高达2×10^-10， 离子在里面处于近乎理想的状态在来回振荡，在这么小的范围，超高真空的高频率振荡下，损失非常小，可以保持灵敏度。另外，Q-Exactive采用新型 S-lens离子传输光路，和以前的tube lens相比最大的不同在于，S-lens是电压（DC）+射频（RF），而tube lens只有电压，S-lens提高了5倍的离子传输效率。”

　　“ThermoFisher上海演示中心已经安装了Q-Exactive，我们的应用工程师做了19种β-激动剂的定性定量，LOQ低至5 ppt，定量的曲线和RSD都非常好。”

　　

　　用Q-Exactive同时对19种β-激动剂（如：瘦肉精、沙丁胺醇等）定性定量，上图是5ppt浓度下的每种β-激动剂的高分辨率质量的提取色谱图

　　

　　19种β-激动剂的定量结果

　　Speed：速度和通量

　 　针对记者提出的“有人说，Q-TOF和QQQ的速度更高，而Orbitrap速度低”的说法，James表示，“对于仅做目标物定量的实验室，QQQ由 于采用MRM模式，可得到高通量，但在一定时间内的目标物数量仍有限，且建立方法费时。Q-Exactive采用超高分辨模式，在有限时间内的目标物数量是无限的，且不需对每个目标物逐一优化参数，因此Q-Exactive实际上更快更简单。比如，美国某机构做几百种农残测定的方法，用QQQ建方法要三个月，用Q-Exactive建方法缩短到只需一天，就把所有目标物的定量全部做完。对Q-Exactive而言，大大简化了仪器方法的开发！

　 　而对于非目标物、未知物的定性定量，QQQ不能提供有效数据。由于分辨率原因，Q-TOF的HRMS模式定量在可靠性和灵敏度上仍受到一定限制，一般仍采用MS/MS来定量，在优化方法时花费较长的时间。对比来看，Q-Exactive用HRMS来做定性和定量，用MS/MS来做确证，灵敏度高，线性范围宽，是最快的仪器！”

　　另外，Q-Exactive还具有谱图叠加功能（Spectrum Multiplexing）， 能够更好改善信噪比，并提高分析速度。实现方法为：四极杆Q选择离子，送入C-Trap保存，在1秒钟内C-Trap最多可富集保存100个不同的离子， 然后将这些离子一同送入Orbitrap做高分辨率的SIM。这样既提高了灵敏度，又根据四极杆做SIM比Orbitrap快的特点来充分利用了等待时间，提高整体分析速度。

　　Quanfirmation流程：鉴定、定量和确证　　

有机污染物的三种筛查

　　Q-Exactive推出，提出新的“Quanfirmation”工作流程，即可对化合物进行鉴定、定量和确证；在有机污染物的筛查实验中，需要同时实现定性和定量。

　　这类筛查方法可分为三种，已知-已知、已知-未知、未知-未知。下面分别描述Q-Exactive如何实现的。

　　（1）已知-已知（Known Known）筛查

　 　这是我们最常见到的目标物筛查（Target Screening）法。以前常用三重四极杆（QQQ）来实现这类筛查。建立方法时，每一个标准品都建立至少两对MRM，然后编成一个方法，用于实际样品 的筛查。对于几个到几十个化合物，建立方法相对容易；但对于几百甚至上千的化合物，建立方法常要花费几周到几个月的时间，而且，今后在方法中再增加新的待 检化合物时会遇上麻烦——有可能要重新建立方法。

　　使用Q-Exactive建立方法非常简单：质谱方法：把所有要监测的目标物的母离子 精确质量，正/负离子化极性，输入列表（inclusion list），当系统进行全扫描时，会自动检测到同列表内母离子质量的差别在10 ppm的离子，自动做MS/MS（dd-MS²）得到结构并进行化合物确认，而定量分析是用HRMS。色谱方法：只需使用一根普通的HPLC色谱柱，一个常用的色谱条件，即开始运行实验。运行完毕，如果一切都比较理想（比如化合物正常从色谱上流出，LOQ满足要求），就可以直接保存这个成功建立的方法了。

　　实践证明，用Q-Exactive，开发方法时间只需几个小时（QQQ大概要几周到几个月的时间）。 举例中，James建立一个12分钟的实验方法，可同时筛查510种农药残留，灵敏度到ppb级。James强调说，“HPLC在这里的主要工作是把样品 稍微分一下，减少一些离子抑制，一根柱子、一个方法就足以；后面的定性定量靠的都是Q-Exactive的HRMS。”按2002/657/EC指令，1 个HRMS得2分，1个HR MS/MS离子是2.5分，事实上Q-Exactive常可获得多个HR MS/MS，所以得分远远大于4分的化合物识别要求。

　　更神奇的是，由于Q-Exactive灵敏度很高、主要依靠HRMS的选择性，所以可进一步减少前处理，比如：把样品1:1液液提取（LLE），然后离心过滤，再进行100倍的稀释（稀释能有效降低基质效应），然后进样分析，同样可以达到10 ppb的检出限要求。

 不必前处理，稀释后直接分析

　　

　　参考：　　用Exactive快速筛查510种农药

　　（2）已知-未知（Known Unkown）筛查

　 　它是Non-target screening非目标物筛查的一种，和目标物筛查的区别是：分析者虽然知道要测的化合物是哪一类（比如农药残留、法医用的毒物毒品等），但不知道具体 要监测哪些物质，比如农药有几千种，具体监测哪些不清楚。这时，可以把怀疑的任何一种化合物的分子式输入列表，还可以借助已包含3,000多种化合物的精确质量的ExactFinder软件，如果需要推断代谢物的结构，可借助Mass Frontier软件来推断碎裂的机理。

　　（3）未知-未知（Unkown Unkown）筛查

　 　它是Non-target screening非目标物筛查的一种，以前用别的方法和仪器做不了；因为自然界有机物有几千万种，针对一个怀疑有非法添加物的样品，完全不知道应该查什 么。现在由Q-Exactive，配合SIEVE软件，再有一个空白做对照的Control样，就可以进行筛查了。

　　方法是：为使统计学上有意义，每个样品至少做三次，用SIEVE软件先将样品和Control样的谱图对齐（Alignment），然后自动分成许多（如：980,000 个）小方块，再去比较每一个小方块里样品和Control样的差异，如果样品里有某个m/z，而Control样里没有这个m/z，就可以找到显著的差 异；再用PCA主成份分析法来分析这种找到的差异，判断其在统计上是不是可靠的。James举了许多筛查非法添加物或掺假化合物的实例。

　　注：SIEVE软件本来是Thermo Scientific为蛋白质组学和代谢组学设计的软件。

　　

　　完全未知化合物的筛查和确认

　　Q-Exactive：满足食品安全检测实验室现在和将来的需求

　 　据了解，目前，Q-Exactive已经被美国各个食品安全检测实验室运用到筛查试验中。王勇为经理总结道，“Q-Exactive具有高分辨率、高灵 敏度、高稳定性、高通量、动态范围宽等特性，非常适合于应对食品安全不断出现的新挑战。它为食品企业、食品检测机构等提供了一种新的选择，既可以做原来三 重四极杆上实现的目标物定量和筛查方法，也可以满足实验室未来面临的非目标物筛查的需求——如完全未知物的检测”。

　　“我们相信，Q-Exactive将大大地改变原先食品安全实验室的工作流程。”

　　Q-Exactive：初级实验员培训数小时，就能完成几百种化合物的定性定量

　 　James补充说，“Q-Exactive用HRMS来定量，具有非常高的分辨率和灵敏度，它使原来极其复杂的试验变得特别简单：不需要反复优化色谱条 件、不需要反复优化碰撞能、不需要复杂的前处理。对一个完全不懂液质联用的生手来说，Q-Exactvie可以让他/她在几个小时内学会成百上千种化合物 的定性、定量和确证。”

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Q Exactive台式FT 轨 道 阱 质 谱 仪