甲基化特异性PCR

MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因 组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。

DNA

亚硫酸氢钠 氢醌 石蜡油 乙醇

水浴锅 PCR仪

1.  在50 ul 体系中，DNA（2~5 ug）经NaOH（终浓度值0.2 mol/L）在37℃变性10 Min。

2.  对于ng级别的人基因组DNA，在进行修饰前加入2 ug蛙鱼精DNA为载体。

3.  加入30 ul 刚配制好的10 mmo/L 氢醌与520/1的40.5%亚硫酸氢钠混匀。

4.  然后用石蜡油隔绝空气的条件下，避光在50%温育16 h。

5.  修饰后的DNA过WizerdDNA纯化柱，用50/1 L 水洗脱。

6.  室温下用NaOH（终浓度为0.3 mol/L）修饰5 min，之后用乙醇沉淀。

7.  DNA溶于20 ul 水中，立即使用或在-20℃保存。

1. 3M亚硫酸氢钠(pH5.0)和10mM对苯二酚需要临用前新鲜配制。

2. Bisulfate处理后的DNA样本易降解，应尽快使用，尽量减少反复冻融，使用时样品保持在冰上，使用后剩余样品尽快放回至-20℃冻存；若较长期保存应放置在-80℃。

3. 每次PCR反应都应设置甲基化阳性对照(IVD)和非处理样品对照(非甲基化阳性对照)。

4. 不同基因和不同样本的MS—PCR反应参数往往不相同，尤其是退火温度和反应循环数等，有时需要通过反复的预实验确定最佳反应参数。

1.引物因素分析MSP的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。MSP的引物设计与普通的PCR引物设计不同，MSP的引物设计原理是：模板DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C—U。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR扩增。MSP的引物序列中至少含有1个以上CpG位点，最好是含有多个CpG位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA序列设计，同时也应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP扩增时，至少要合成2对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初涉及MSP者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到的相应MSP引物，可用在线MethPrimer软件在线设计引物，网址为http：／／www.urogene.org／methprimer／index1.html。根据软件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较高，MSP扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5.0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率<30％ 的引物要进行优化，方法是：在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。

2.MSP的反应体系问题MSP的反应体系的成分与普通PCR一样，反应体系的优化也与普通类似，反应体系的优化与普通PCR的反应体系中最大的区别是DNA模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP的DNA模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260／A280在1.8——2.0之间；其含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加的太多而导致DNA处理不完全而导致MSP扩增失败；而加的DNA模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性。Mg“浓度一般在2.0——2.5 mmoL／L为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR的缓冲液及Taq酶的来源也很重要，一般的PCR缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的Taq酶也会影响结果的重复性。我们建议用Taka—ra公司针对富含CG等复杂二级结构模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq酶后，不要轻易更换，以免MSP因重新优化而引起的时间和成本的浪费。

3.MSP的反应温度分析MSP扩增的结果有3种情况：（1）产物电泳为阴性；（2）产物电泳出现多条非特异性条带（含目的基因条带）；（3）产物电泳为阳性（仅目的基因条带）。出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带。方法如下：PCR反应中，Tm的高低与CG含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR偏性。我们建议，提高预变性温度（一般应>95℃，10 rain）和变性温度（>95℃ ，1 min），退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。