电子显微镜生物标本的制备及观察实验

家兔

透射电子显微镜 超薄切片机 解剖镜 震荡器 恒温箱 干燥器 离子镀膜机 单面刀片 铜网 解剖器材

乙醚 戊二醛 二甲砷酸钠缓冲液 锇酸 乙醇 丙酮 环氧树脂包埋剂 醋酸铀染液 柠檬酸铅染液 单宁酸 乙酸异戊脂

一、取材

1.  取活兔用乙醚麻醉，迅速打开腹腔，暴露肝脏，用锋利的刀片切取1 mm³ 肝组织，立即投入固定液中。

2.  取材要求迅速，通常将动物麻醉取材，如动物处死后取材，要在几分钟内完成。

3.  取材最好在低温条件下进行（0~4℃），以防止动物死后细胞缺氧发生超微结构变化。

图1  透射电镜结构

二、固定

1.  把肝组织立即投入到0.1 mol/L（pH7.4）的二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛中，4℃固定二小时（也可用0.1 mol/L （pH7.4）的磷酸缓冲液配制的2.5%戊二醛）。

2.  然后用0.1 mol/L（pH7.4）的二甲砷酸钠缓冲液洗三次，再放入用相同缓冲液配制的1%锇酸中固定2小时（4℃）。

3.  固定的作用是用化学试剂使细胞的微细结构如同生前状态精确地保存下来。

4.  固定剂应能迅速进入细胞，稳定细胞结构，使其不变形，在脱水过程中不丢失细胞成分。

三、脱水

1.  用双蒸水清洗固定好的肝脏标本，按顺序投入到30%、50%、70%的乙醇中，在4℃条件下各10分钟。

2.  然后再投入到80%、90%、95%的丙酮中各10分钟，100%的丙酮中两次，每次10分钟，一般可在室温下进行（如实验需中途停顿可把标本放在70%乙醇中过夜）。

3.  脱水的目的是用脱水剂，把组织细胞内的游离水去除干净，使包埋剂能够均匀地渗入细胞内。

四、浸透

1.  把标本由100%丙酮中移入装有混匀包埋剂的小瓶中，在30℃下震荡4小时（可用红外线灯加温促进浸透）使包埋剂置换出标本中的丙酮。

2.  电镜生物标本常用环氧树脂作包埋剂，聚合后可切成超薄切片，并耐电子束轰击。

五、包埋

1.  把标本放入胶囊底部，将混匀的包埋剂分装入胶囊中，加好标签，勿使倾倒保持直立。

六、聚合

1.  把装有标本和包埋剂的胶囊置35℃、45℃、60℃温箱中各24小时，使包埋剂聚合，硬化。

2.  由流体变为均匀的固体。这样在切片时，包埋在其内的肝组织才能保持结构不变。

七、超薄切片

1.  一般透射电镜的切片厚度不能超过100 nm，厚于100 nm 的切片电子束不能穿透或影响观察效果。

2.  通常超薄切片厚度为50~70 nm。

3.  在切片前，要对标本包埋块顶端修成近45℃角的四边锥体，使要进行切片的标本露出外表面，呈长宽约为0.4x0.6 mm 的长方形或梯形切面。

4.  然后再把标本块夹在标本夹中，并把它固定在切片机臂的远端。

5.  切片刀是用玻璃制成（也可用钻石刀），甩胶布围成水槽，装满水，切下的切片漂在水面，用铜网收集。

6.  切片的厚度可以从切片与水面反射光所产生的干涉色来判断。

八、染色

1.  在平皿中放一腊纸片，滴一滴醋酸铀染液于腊纸上。

2.  用弯头小镊子夹住铜网边缘，把贴有切片的一面朝下，轻轻插入染液中，盖上平皿盖，室温下染色10~20分钟。

3.  水洗后同上法再置入柠檬酸铅染液中染色15分钟，1%NaOH溶液洗一次，水洗二次，干燥后观察。

4.  染色的原理是利用重金属（如铅、铀等）与组织中某些成分结合，可提高这些组分对电子的散射能力，增进超薄切片中不同组织成分对电子散射的差异，使细胞的超微结构得到充分表现，形成与细胞结构相应的图像，并提高图像反差，也称电子染色。

九、观察家兔肝细胞的超微结构

1.  肝细胞的结构：

（1）肝细胞为多角形，一侧靠近血窦。

（2）核圆形1~2个，位于细胞中央，核仁1~2个。

（3）细胞质中有各种细胞器，粗面内质网的膜平行排列，聚集在一起。

（4）滑面内质网为分支弯曲的囊管组成，互相吻合成网，排列密集。

（5）高尔基复合体排列在核的周围。

（6）还可见到溶酶体、过氧化物体、糖原、脂滴、分泌颗粒等。