电子显微镜生物样品的制备实验

一、目的要求

学习并掌握制备微生物及核酸电镜样品的基本方法。

二、电子显微镜与光学显微镜的主要区别

显微镜的分辨率取决于所用光的波长，1933年开始出现的电子显微镜正是由于使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，使其所能达到的分辨率较光学显微镜大大提高。而光源的不同，也决定了电子显微镜与光学显微镜的一系列差异。

根据电子束作用于样品的方式的不同及成像原理的差异，现代电子显微镜已发展形成了许多种类型，目前最常用的是透射电子显微镜（transmission electron microscope）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope），前者总放大倍数可在1000～1000000倍范围内变化，后者总放大倍数可在20～300000倍之间变化。本实验主要介绍这两种显微镜样品的制备。

三、器材

1、菌种 大肠杆菌（大肠埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。

2、溶液或试剂  醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2%磷钨酸钠（pH6.5～8.0）水溶液，0.3%聚乙烯甲醛（溶于三氯甲烷）溶液，细胞色素C，醋酸铵，质粒pBR322。

3、仪器或其他用具 普通光学显微镜，铜网，瓷漏斗，烧杯，平皿，无菌滴管，无菌镊子，大头针，载玻片，细菌计数板，真空镀膜机，临界点干燥仪等。

四、操作步骤

（一）透射电镜的样品制备及观察

1、金属网的处理

光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察。而在透射电镜中，由于电子不能穿透玻璃，只能采用网状材料作为载物，通常称为载网。载网因材料及形状的不同可分为多种不同的规格，其中最常用的是200～400目（孔数）的铜网。网在使用前要处理，除去其上的污物，否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度。

本实验选用的是400目的铜网，可用如下方法进行处理：首先用醋酸戊酯浸漂几小时，再用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水。如果铜网经以上方法处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）浸1～2分钟，或在1%NaOH溶液中煮沸数分钟，用蒸馏水冲洗数次后，放入无水乙醇中脱水，待用。

2、支持膜的制备

在进行样品观察时，在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜，否则细小的样品会从载网的孔中漏出去，这层薄膜通常称为支持膜或载膜。

支持膜应对电子透明，其厚度一般应低于20nm；在电子束的冲击下，该膜还应有一定的机械强度，能保持结构的稳定，并拥有良好的导热性；此外，支持网在电镜下应无可见的结构，且不与承载的样品发生化学反应，不干扰对样品的观察，其厚度一般为15nm左右。

支持膜可用塑料膜（如火棉膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。常规工作条件下，用塑料膜就可以达到要求，而塑料膜中火棉胶膜的制备相对容易，但强度不如聚乙烯甲醛膜。

（1）火棉胶棉的制备   在一干净容器（烧杯、平皿或下带止水夹的瓷漏斗）中放入一定量的无菌水，用无菌滴管吸2%火棉胶醋酸戊酯溶液，滴一滴于水面中央，勿振动，待醋酸戊酯蒸发，火膜胶则由于水的张力随即在水面上形成一层薄膜。用镊子将它除掉，再重复一次此操作，主要是为了清除水面上的杂质。

然后适量滴一滴火棉胶液于水面，火棉胶液滴加量的多少与形成膜的厚薄有关，待膜形成后，检查是否有皱折，如有，则除去一直待膜制好。所用溶液中不能有水分及杂质，否则形成的膜的质量较差。待膜成型后，可以侧面对光检查所形成的膜是否平整及是否有杂质。